NGS文库制备须注意哪些重要环节？[新品推荐]

在新一代测序（NGS）中，文库质量是决定实验是否成功的最重要因素，因此，文库制备的每个环节都要确保万无一失。若文库质量不佳，有可能影响序列的可靠性，并为重复性蒙上阴影。在文库制备时，我们应根据应用、仪器和读长来选择适当的方案。下面有一些具体的建议。

考虑起始材料的质量

起始材料的质量可不容小觑，它不仅大大影响了文库质量，也决定了下游的测序结果。若要实现完美读长和精准测序，高质量且高分子量的核酸是必不可少的。具体的标准大家都清楚，那就是DNA分子量高，A260/280的比值介于1.8和2.0之间，且不含有污染物，如苯酚或乙醇。

PerkinElmer多年来一直在开发高质量的文库制备方法。它家的自动化核酸提取是基于chemagic™磁珠法核酸提取技术，带来了高纯度和高产量。chemagic技术使用专门的磁珠，与核酸亲和力高，与蛋白亲和力低，产生了高分子量且超高纯度的核酸。

对于核酸定量和质量控制，PerkinElmer的DropletQuant紫外/可见光分光光度计能够全面评估样品中的杂质。它借助微流体的优势进行光谱扫描，从而分析污染物。光谱可与已知污染物的数据库相关联，让您明确了解污染物的成分。

最近，PerkinElmer还与10X Genomics合作，进一步改善各种起始材料的提取和定量。10X Genomics的Chromium™ Genome Solution本质上是一种巧妙的Barcoding技术，它让来源于同一条高分子量DNA的片段，带上相同的一段DNA序列标记（Barcode），便于测序后的拼接。这一技术与PerkinElmer的chemagic技术相结合，让起始量低至1ng的样品轻松实现高通量测序。

维持高的复杂度

测序文库的质量何谓高？还有一个条件，那就是覆盖均匀。理想的NGS文库必须完美代表起始材料，这样在测序时，序列才能均匀地分布在整个感兴趣的区域。不幸的是，这很难实现。有些区域几乎没有覆盖到，而有些区域又覆盖多次。导致这种状况出现的原因之一是文库的复杂度不佳。

“一个高度复杂的文库应该忠实地反映了起始材料的复杂程度，这就需要高效的文库制备流程，能够将尽可能多的分子转化成最终的文库分子，并且保证这些分子是唯一的、可测序的，”罗氏测序部门的经理Jennifer Pavlica解释道。

KAPA Hyper Prep/Hyper Plus Kit在转化效率和文库质量上是有口皆碑的。这些试剂盒采用简化的流程，将起始分子高效转化成最终的文库分子。它们针对各种应用而优化，可根据样品类型和起始量来调整流程。试剂盒中的KAPA HiFi DNA聚合酶可最大限度降低GC偏倚，维持高复杂度。

Roche的KAPA Hyper Prep Kit适合各种类型的样品，比如起始量超低的DNA样品。它也适合各种应用，包括ChIP-Seq，即染色质免疫沉淀后接着开展NGS，这是研究DNA与蛋白质（如转录因子和组蛋白修饰）相互作用的一种可靠方法。

文库的纯化和标记

在NGS文库制备过程中，纯化也是不可忽视的一方面。QIAGEN的基因组学业务经理Dan Heard表示：“在文库制备过程的不同阶段会采用不同的纯化策略，如磁珠纯化或柱纯化。以往，miRNA测序流程离不开凝胶切割，这有助于选择大小合适的片段，并减少接头二聚体，不过这是一个耗时的过程。我们的技术使用了高度优化的试剂和连续的磁珠纯化步骤，产生了超纯的文库。”

QIAGEN的QIAseq 1-Step Amplicon Library Kit增加了两个额外的纯化步骤，以确保高质量的文库生成。一管式的操作避免了转移试剂的麻烦，在提高实验效率的同时也减少了污染的风险。这种方法也可以是PCR free的，避免引入序列重复或PCR偏倚。

分子条形码的引入有助于追踪原有的DNA或RNA分子，检出稀有变异，获得准确的拷贝数和表达数据，并提升多重检测能力，从而大大增加对测序结果的信心。QIAGEN的数字NGS技术利用分子索引对DNA、RNA和miRNA进行无偏倚的定量，可在所有测序平台上更准确地检测分子变异。

单细胞测序新方法

单细胞测序是研究单个细胞的基因组或转录组，深度评估细胞之间的差异。然而，这极具挑战性，因为研究单个细胞比研究大量细胞要困难得多，每个细胞中只有微量的RNA。Illumina的SureCell Whole Transcriptome Analysis (WTA) 3’ Kit是专为单细胞RNA测序而优化的，能够从少量样品中生成高质量的产物。

Illumina产品经理Kevin Taylor表示：“SureCell WTA 3’ Library Prep Kit是Illumina与Bio-Rad合作推出的第一款同类产品。它的与众不同之处在于单细胞文库是利用cDNA的直接tagmentation（片段化和标记）产生的，而不需要剪切或预扩增。”

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此外，文库制备的速度和简便也是人们关注的焦点。PerkinElmer等公司正在使用如今大热的人工智能来进一步改善文库制备。它的IntelliChip™技术可最大程度地减少标准偏差以及运行间的差异，提高文库制备的重复性。未来，更多的创新有望融入NGS，带来全方位的提升。

（作者：Jen Ellis / 生物通编译）