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NGS文库制备须注意哪些重要环节?[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年11月27日 来源:生物通

摘要:

  在新一代测序(NGS)中,文库质量是决定实验是否成功的最重要因素,因此,文库制备的每个环节都要确保万无一失。若文库质量不佳,有可能影响序列的可靠性,并为重复性蒙上阴影。在文库制备时,我们应根据应用、仪器和读长来选择适当的方案。下面有一些具体的建议。

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在新一代测序(NGS)中,文库质量是决定实验是否成功的最重要因素,因此,文库制备的每个环节都要确保万无一失。若文库质量不佳,有可能影响序列的可靠性,并为重复性蒙上阴影。在文库制备时,我们应根据应用、仪器和读长来选择适当的方案。下面有一些具体的建议。

考虑起始材料的质量

起始材料的质量可不容小觑,它不仅大大影响了文库质量,也决定了下游的测序结果。若要实现完美读长和精准测序,高质量且高分子量的核酸是必不可少的。具体的标准大家都清楚,那就是DNA分子量高,A260/280的比值介于1.8和2.0之间,且不含有污染物,如苯酚或乙醇。

PerkinElmer多年来一直在开发高质量的文库制备方法。它家的自动化核酸提取是基于chemagic™磁珠法核酸提取技术,带来了高纯度和高产量。chemagic技术使用专门的磁珠,与核酸亲和力高,与蛋白亲和力低,产生了高分子量且超高纯度的核酸。

对于核酸定量和质量控制,PerkinElmer的DropletQuant紫外/可见光分光光度计能够全面评估样品中的杂质。它借助微流体的优势进行光谱扫描,从而分析污染物。光谱可与已知污染物的数据库相关联,让您明确了解污染物的成分。

最近,PerkinElmer还与10X Genomics合作,进一步改善各种起始材料的提取和定量。10X Genomics的Chromium™ Genome Solution本质上是一种巧妙的Barcoding技术,它让来源于同一条高分子量DNA的片段,带上相同的一段DNA序列标记(Barcode),便于测序后的拼接。这一技术与PerkinElmer的chemagic技术相结合,让起始量低至1ng的样品轻松实现高通量测序。

维持高的复杂度

测序文库的质量何谓高?还有一个条件,那就是覆盖均匀。理想的NGS文库必须完美代表起始材料,这样在测序时,序列才能均匀地分布在整个感兴趣的区域。不幸的是,这很难实现。有些区域几乎没有覆盖到,而有些区域又覆盖多次。导致这种状况出现的原因之一是文库的复杂度不佳。

“一个高度复杂的文库应该忠实地反映了起始材料的复杂程度,这就需要高效的文库制备流程,能够将尽可能多的分子转化成最终的文库分子,并且保证这些分子是唯一的、可测序的,”罗氏测序部门的经理Jennifer Pavlica解释道。

KAPA Hyper Prep/Hyper Plus Kit在转化效率和文库质量上是有口皆碑的。这些试剂盒采用简化的流程,将起始分子高效转化成最终的文库分子。它们针对各种应用而优化,可根据样品类型和起始量来调整流程。试剂盒中的KAPA HiFi DNA聚合酶可最大限度降低GC偏倚,维持高复杂度。

Roche的KAPA Hyper Prep Kit适合各种类型的样品,比如起始量超低的DNA样品。它也适合各种应用,包括ChIP-Seq,即染色质免疫沉淀后接着开展NGS,这是研究DNA与蛋白质(如转录因子和组蛋白修饰)相互作用的一种可靠方法。

文库的纯化和标记

在NGS文库制备过程中,纯化也是不可忽视的一方面。QIAGEN的基因组学业务经理Dan Heard表示:“在文库制备过程的不同阶段会采用不同的纯化策略,如磁珠纯化或柱纯化。以往,miRNA测序流程离不开凝胶切割,这有助于选择大小合适的片段,并减少接头二聚体,不过这是一个耗时的过程。我们的技术使用了高度优化的试剂和连续的磁珠纯化步骤,产生了超纯的文库。”

QIAGEN的QIAseq 1-Step Amplicon Library Kit增加了两个额外的纯化步骤,以确保高质量的文库生成。一管式的操作避免了转移试剂的麻烦,在提高实验效率的同时也减少了污染的风险。这种方法也可以是PCR free的,避免引入序列重复或PCR偏倚。

分子条形码的引入有助于追踪原有的DNA或RNA分子,检出稀有变异,获得准确的拷贝数和表达数据,并提升多重检测能力,从而大大增加对测序结果的信心。QIAGEN的数字NGS技术利用分子索引对DNA、RNA和miRNA进行无偏倚的定量,可在所有测序平台上更准确地检测分子变异。

单细胞测序新方法

单细胞测序是研究单个细胞的基因组或转录组,深度评估细胞之间的差异。然而,这极具挑战性,因为研究单个细胞比研究大量细胞要困难得多,每个细胞中只有微量的RNA。Illumina的SureCell Whole Transcriptome Analysis (WTA) 3’ Kit是专为单细胞RNA测序而优化的,能够从少量样品中生成高质量的产物。

Illumina产品经理Kevin Taylor表示:“SureCell WTA 3’ Library Prep Kit是Illumina与Bio-Rad合作推出的第一款同类产品。它的与众不同之处在于单细胞文库是利用cDNA的直接tagmentation(片段化和标记)产生的,而不需要剪切或预扩增。”

了解Illumina的更多单细胞测序方案及产品

此外,文库制备的速度和简便也是人们关注的焦点。PerkinElmer等公司正在使用如今大热的人工智能来进一步改善文库制备。它的IntelliChip™技术可最大程度地减少标准偏差以及运行间的差异,提高文库制备的重复性。未来,更多的创新有望融入NGS,带来全方位的提升。

(作者:Jen Ellis / 生物通编译)

(http://www.ebiotrade.com/)
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