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Cas13a:一种与众不同的CRISPR核酸酶

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年11月9日 来源:生物通

摘要:

  一种新型核酸酶Cas13a(以前称为C2c2)正逐渐走进人们的视野,它具有独特的性质,进一步扩展了CRISPR工具箱。在此,我们将介绍一下Cas13a的独特性质以及各种应用。

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CRISPR是一种出色的基因组编辑工具,深受研究人员的欢迎。其中,大家比较熟悉的是来自化脓链球菌的Cas9(SpCas9)。不过,这并不是唯一的选择。一种新型核酸酶Cas13a(以前称为C2c2)正逐渐走进人们的视野,它具有独特的性质,进一步扩展了CRISPR工具箱。在此,我们将介绍一下Cas13a的独特性质以及各种应用。

独特之处

Cas13a最初是由Broad研究所的研究人员发现的。2015年,Shmakov及其同事利用Cas1作为“诱饵”,来鉴定细菌基因组中与CRISPR相关联的蛋白。通过此次分析,他们鉴定出53个候选基因,总共分成三大类:C2c1、C2c2和C2c3。C2c1和C2c3与Cpf1有些类似,不过它们需要tracrRNA和crRNA才能切割DNA目标,而Cpf1仅需要crRNA。

再来看C2c2(也就是Cas13a)与Cas9的区别。最大的区别在于Cas13a结合并切割RNA,而Cas9切割DNA。从结构上来看,Cas13a含有两个HEPN结构域,而Cas9用HNH和RuvC结构域来切割DNA目标。HEPN结构域对Cas13a切割RNA目标是必需的。另外,与Cas9类似,Cas13a分子中关键残基的突变可以形成核酸酶活性缺失的Cas13a(dCas13a),它能够结合RNA目标但无法切割。

表1:比较常用的CRISPR酶

名称

结构域

向导RNA

目标

PAM

切割机制

Cas9

HNHRuvC

tracrRNAcrRNA

DNA

5' NGG

DNA目标中平末端的特定双链断裂

Cpf1

类似RuvC

crRNA

DNA

5' TTN

DNA目标中带有5’垂悬的特定双链断裂

Cas13a

2x HEPN

crRNA

RNA

3' AU C

特定RNA的切割

作用机制

大家都知道,Cas9利用tracrRNA和crRNA来实现与DNA目标的结合和切割。不过,Cas13a只需要24个碱基的crRNA,它通过富含尿嘧啶的茎环结构与Cas13a分子相互作用,并通过Cas13a的一系列构象变化来促进目标的切割。与Cas9一样,Cas13a也能容忍crRNA与目标序列之间的单个错配,不过若存在2个错配,那切割效率就大大降低。它的PFS序列(相当于PAM序列)位于间隔区的3’端,由A、U 或C碱基组成。

Cas13a还有一个特别之处,那就是Cas13a一旦识别并切割由crRNA序列指定的RNA目标,它就转入了一种酶促“激活”状态,这时它将结合并切割其他的RNA,而不管它们是否与crRNA同源,或是否存在PFS。这一点与Cas9截然不同。对于细菌而言,这种性质是有意义的。若细菌被噬菌体感染,它能够激活程序性细胞死亡或休眠状态,以限制感染在整个群体中的传播。

潜在应用

那么,Cas13a可以应用在哪些方面呢?对于初学者来说,Cas13a可用来结合和切割RNA目标,不过这方面的应用可能受限,因为一旦目标被破坏,Cas13a就会失去控制。因此,Cas13a的突变体研究有望成为新的热点,使其特异切割RNA目标,但是随后不会切割非特异的RNA。此外,人们可利用dCas13a来分离群体中的特定RNA序列,或利用荧光标记的dCas13a来研究活细胞中的RNA加工。

最近,张锋实验室还发表了一篇文章,证明了Cas13a可以高特异性地检测RNA单分子。他们开发出的SHERLOCK系统可检测血清、尿液和唾液中低浓度的寨卡病毒,并确定病毒载量,区分不同病毒株。它还可以对人类DNA进行基因分型,并鉴定游离DNA中的肿瘤突变。未来,Cas13a有望继续扩大CRISPR的应用范围。(生物通 薄荷)

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