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捕获BCR转录本完整V(D)J 可变区:SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年12月14日 来源:Takara

摘要:

  Takara新推出的SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技术,提供了一种灵敏,准确,优化的BCR库分析方法。

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众所周知,B 细胞是适应性免疫应答的重要组成部分,其表面表达B细胞受体(BCR),可以识别病原体中的特定分子模式。

了解BCRs图谱(也就是由特定H,K,L基因片段构成的受体和克隆型多样性)不仅有助于深入了解健康个体中的适应性免疫应答,也有助于了解多种疾病的适应性免疫应答。准确确定免疫系统表达的克隆型和同种型有助于全面了解B细胞群体。

新推出的SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit基于5’RACE和NGS技术,提供了一种灵敏,准确,优化的BCR库分析方法。

虽然采用多重PCR可以在一个反应中对多个BCR基因进行扩增,但也被证明在对特定序列进行扩增时存在灵敏度,特异性和偏差的问题,这些都可能带来同种型的鉴别困难。而5’RACE方法减少了变异性并且可以从BCR重链或轻链的恒定区引发扩增。

试剂盒将这些优点与基因特异性扩增相结合可以捕获BCR完整V(D)J可变区,提供了一种高灵敏度、可重复的B细胞库分析方法。在大部分情况下,通过H/K/L链的下游测序分析可以准确鉴别克隆型,可靠确定同种型。


 
图1. BCR重排过程。

祖细胞发育过程中胚系基因片段经过V,D,J重排形成两条相同的重链。V,J片段重排形成两条相同的轻链。V,D,J片段连接处的核苷酸随机插入或缺失增加了额外的多样性。B细胞经过免疫应答刺激后通过体细胞高频突变(SHM)进一步引入更多的点突变。 


 
图2. SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit技术流程。

PanelA dT-引物起始合成一链cDNA,经过两轮PCR扩增合成cDNA文库。PCR产物经纯化,片段筛选和质量检测后用于测序分析。

PanelB对于每个样品,在样品中所有mRNA 进行RT反应后,使用者可以通过两轮基因特异性巢式PCR特定扩增IgG 的1-3条链。


 
图3. 准确扩增所有5种IgG亚类。

以来自于不同IgG亚型的自有杂交瘤(10E8)和两个ATCC杂交瘤样品(HB-8117和TIB-127)的10 ng RNA起始,采用SMARTer Mouse BCR IgG H/K/L Profiling Kit构建包含BCR重链和轻链(kappa)的文库。Panel A Bioanalyzer结果显示了每个杂交瘤重链和轻链的基因特异性扩增结果。在每个样品中都观察到了700-900 bp的预期峰值。电泳图中明显的峰表明在这些杂交瘤中表达kappa链。相反,lambda链测序库相对较宽并且大小低于预期。每个样品中标注为“LM”和“UM”的峰为DNA reference marker。Panel B 采用MiXCR软件(version 1.8)确定比对指标,与所有IG序列进行了比对分析。MiXCR软件对前2个克隆的分析结果显示了V,D,J等位基因及通过软件分析确定的同种型和亚类。

(http://www.ebiotrade.com/)

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