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在亚细胞水平检测/定位/定量RNA分子:Stellaris RNA FISH,lncRNA/mRNA研究利器

【字体: 时间:2017年02月21日 来源:生物通

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  RNA分子在细胞里的定位很可能与其功能有联系。了解目标在细胞哪里分布有助于了解其功能。Stellaris®的RNA FISH无需分离,纯化和扩增,就可以通过直接检测来可视化RNA,从而追踪“飘忽难确定的”RNA分子或者基因表达。聪明的多探针设计使得其兼顾高灵敏度和高特异性,mRNA ,lncRNA研究利器,推荐了解一下

RNA分子在细胞里的定位很可能与其功能有联系。要研究其功能您当然得搞清楚目标在哪里分布。Stellaris®的RNA荧光原位杂交是一个RNA可视化方法,在荧光显微镜下、在亚细胞水​​平上对固定样品中的特定RNA分子进行检测,定位,和定量。一组Stellaris RNA FISH探针包含有多个不同序列的荧光标记寡核苷酸,能共同沿着目标序列结合在同一检测目标上并产生点状荧光信号。

聪明设计

用反义RNA长探针虽然专一性高,但是长片段标记的不均匀和长片段可以结合多个分子,使得结果的信号很不均匀且不容易定量比较,后来采用标记的合成寡核苷酸探针进行RNA FISH,则短探针存在特异性低,每个探针信号非常低的问题。

Stellaris RNA FISH探针组的特点是对同一目标使用多个不同序列的探针来确保高灵敏度和特异性。阳性信号来自结合在同一目标上多个局部探针的组合荧光。例如,每个RNA分子设计30-48个独立的单基团标记的探针,这相当于在一个目标分子上安插了这么多荧光标记,使得信号明显增强。单个探针的脱靶结合仅产生弱的和扩散的荧光,远低于检测特异性目标RNA的阈值。这种设计使得它可以结合部分降解的靶RNA——只要没完全降解,残留的序列依然有部分探针可以识别结合并向您打小报告,无所遁形——所以这种方法非常适合福尔马林固定的石蜡包埋(FFPE)组织样品。

Stellaris RNA FISH技术遵循一个简单的方案,不需使用外来试剂,便宜(嗯,相对的),和平台无关;可提供当天的结果,很多样品类型和应用适用。 Stellaris RNA FISH探针甚至可以用几种不同的染料标记,以实现不同RNA靶标的同时多重检测。借助这种方法,您可以无需分离,纯化和扩增,通过直接检测来可视化RNA,从而追踪“飘忽难确定的”RNA分子或者基因表达。

步骤简单

Stellaris RNA FISH方法相对简单,由四个步骤组成,如下图所示。不需要特殊试剂,整个过程可以在不到一天内完成。

步骤1:准备样品:样品在#1盖玻片上生长或粘附或切片,并用70%乙醇透化。不同生物体和样品类型之间的样品制备方案也许会有轻微变化。不需要蛋白酶。

步骤2:杂交探针:对于大多数样品,杂交可以在常规实验室培养箱中+ 37℃下在4小时内完成。

步骤3:洗涤样品:杂交后,用洗涤缓冲液短暂孵育来除去过量的探针。此步骤的总时间为1 - 1.5小时。

步骤4:样本成像:可以使用标准荧光显微镜成像。建议使用宽场荧光显微镜,虽然共聚焦显微镜也可以使用Stellaris RNA FISH探针。

 

Stellaris RNA FISH探针提供多种荧光标记,包括Biosearch Technologies的CALFluor®和Quasar®染料,均可用于多重检测。多重检测中的荧光标记的选择在很大程度上取决于您可用的滤光片。可以设计包括DAPI核染色和三种具有最小的光谱重叠荧光标记的Stellaris RNA FISH探针组的检测。

多重检测可用于鉴定多个RNA分子之间的表达水平的相关性,例如用已知表达的对照探针组与目标同时检测。厂家提供适合用作阳性对照的人类细胞库存探针组,这些基础的探针集一般用Quasar 570染料标记。Quasar®染料可作为Cy™染料的直接替代品,它们具有相同的发色团结构和光谱性质,连接试剂不同,表现相同。 Quasar 570代替Cy3,Quasar 670代替Cy5,Quasar 705代替Cy5.5染料。 Quasar染料可作以亚酰胺(amidite)形式在寡核苷酸合成期间掺入,因此不需要在合成寡核苷酸后进行标记(偶联荧光基团)。Quasar稍微更疏水,可溶于DNA合成试剂。

在lncRNA研究中的应用

长的非编码RNA(lncRNA)靶由于缺乏蛋白质产物和通常存在多个剪接变体,其研究颇具挑战性。RNA FISH技术能实现对lncRNA的定位,定量和检测,对于长非编码RNA(lncRNA)非常重要。Biosearch的研究人员给出了一种简化的RNA FISH方案,可以在固定哺乳动物细胞中同时成像多种原始和成熟mRNA和lncRNA基因产物和RNA变体,使得RNA FISH技术增加了区分初级和成熟lncRNA转录物的能力,并因此可将lncRNA的作用位点与合成位点区分。

该方法利用荧光预标记的短DNA寡核苷酸(长度约20个核苷酸),合并成多达48个单独探针的组。多个寡核苷酸与相同RNA靶标的整体结合,共同产生的点状斑点荧光信号可显示RNA或单RNA分子的簇,而不需要酶信号扩增。通过使用宽视场荧光显微术,这些点状信号的可视化使单个转录物的计数灵敏度提高到每个细胞一个拷贝。另外,通过使用不同光谱荧光基团的探针组,可以实现基因特异性RNA或RNA变体的多重分析。这种方法能够在转录事件和成熟lncRNA的位置和耐久性之间添加时间空间信息。通过图像的后处理和点计数,可证明这种方法用于统计分析每个细胞的RNA分子的能力。该信息可用于确定总体基因表达水平和细胞与细胞基因表达变异。详情请联系基因有限公司

其他

Stellaris RNA FISH还可以与现有技术例如qPCR,DNA FISH,IHC(免疫组织化学)和western印迹结合以提供补充信息。

Biosearch作为寡核苷酸合成大厂,有丰富的Shipready即用型探针可供选择,如果还找不到合适的,恭喜您目标独到领先不随大流之余,还告诉您Biosearch的人性化服务可以专门为您感兴趣的RNA序列设计一套匹配的寡核苷酸探针,回避可能有疑义的会产生背景的保守区同源区等等等等,为您合成这些探针组,并用您选择的荧光基团标记。怎么样,约不约?

 

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