李慧林：解开生命基本法则的“环”之谜

美国文安德尔研究所等处的研究人员最近详细描述了DNA复制中的关键第一步，文章的通讯作者之一，文安德尔研究所的表观遗传学中心教授李慧林博士说，“这是关于一个‘王者’环的故事。生物学家多年前就已经知道，ORC和解旋酶是DNA复制起始和复制进程中必不可少的环状结构，但到目前为止，我们从未了解ORC环如何将解旋酶环装载到DNA上的。”

　　

生物通报道：中心法则是遗传信息从DNA到DNA的复制、继而从DNA传递给RNA的转录、再从RNA传递给蛋白质的翻译过程的转移法则，是生物大分子DNA、RNA和蛋白质参与细胞生命活动所遵循的重要规律。其中DNA复制就是这一法则的第一步，也是最重要的一步，虽然多年来科学家们解析了这一步骤的多个方面，但是关于复制起始复合体（ORC）的环状蛋白质依然是个谜。

来自美国文安德尔研究所等处的研究人员最近详细描述了DNA复制中的这个关键第一步，相关研究成果公布在2月13日的Nature Structural & Molecular Biology杂志上，文章的通讯作者之一，文安德尔研究所的表观遗传学中心教授李慧林（Huilin Li，音译）博士说，“这是关于一个‘王者’环的故事。生物学家多年前就已经知道，ORC和解旋酶是DNA复制起始和复制进程中必不可少的环状结构，但到目前为止，我们从未了解ORC环如何将解旋酶环装载到DNA上的。”

多细胞生物在细胞分裂之时进行生长，在细胞分裂之前，它必须为新细胞生成组成元件副本。由于DNA信息被密封在DNA双链内部，访问和复制信息之前一种叫做复制体（replisome）的专门机器必须要解开DNA链。MCM马达是复制体的关键组成部分，它负责解开配对的DNA链。而MCM是一个闭合的蛋白质环，在它环绕DNA长链之前必须首先要打开它，ORC就负责解决这一问题。它可以打开MCM环，让其能够环绕并解开DNA。

这项最新研究揭示了ORC的特殊α-螺旋能进入DNA的一个凹槽中，启动DNA复制的一系列级联微管相互作用。此外研究还发现ORC在Cdc6和Cdt1的帮助下，通过翼状螺旋结构域的配对相互作用将解旋酶核心部分加载到DNA上，这样就会形成14个组合蛋白结构，完成第一个解旋酶环的加载，然后准备加载下一个环。

这整个过程代表了一个非常复杂且精细的系统开始运作，在人体许多细胞中DNA上的数万个位点上不间断工作，它们都是从ORC开始的。

此前的研究表明，ORC是一个六亚基蛋白质复合体，其中有五个亚基形成了一个微微张开的环，第六个亚基Orc6形成了一条尾巴。最新研究显示，亚基组成的复合物形成月牙状，包裹住DNA双链。然后ORC会召集第七种蛋白，也就是Cdc6，绕住DNA。这个环与第二个环相连，微染色体维持蛋白（Cdt1-bound Mcm2-7 hexamer）围绕在DNA周围，完成第一个Mcm2-7六聚体的加载。

“这就像是把一条珍珠串在一根绳子上，不过DNA链更长，因此珍珠不会到达末端。相反它们会沿着链以某种方式打开，之后再次关闭，”文章的另外一位通讯作者，伦敦帝国理工学院教授Christian Speck说。

这项研究是通过冷冻电子显微镜（cryo-EM）完成，李教授表示，“我们希望通过描绘这一过程，能最终将这种知识转化为DNA复制相关的治疗方法，用于包括癌症和罕见病在内的多种疾病的治疗”。

生物通：复制起始复合体（ORC）是DNA复制的关键元件，这项研究主要是采用了什么方法剖析了ORC环状结构的一系列组装过程呢？

李教授：我们采用了cryo-EM方法分析了酿酒酵母OCCM（ORC-Cdc6-Cdt1-Mcm2-7）复合物的结构，这个复合物是由ORC-Cdc6通过Cdt1结合的Mcm2-7六聚体捕获结合而形成的。我们利用体外反应方法获得了复合物：在带有复制起始质粒DNA的试管中将纯化组分如ORC，Cdc6，Cdt1和解旋核心复合物Mcm2-7混合在一起。DNA会连接到磁珠上，然后利用磁性将反应产物——OCCM复合物与反应物分离。

这是一项合作成果，我们文安德尔研究所的实验室完成了冷冻电子显微的结构测定，而样本是由伦敦帝国学院的Christian Speck博士实验室准备的。参与这项工作的还包括冷泉港实验室的Bruce Stillman博士实验室，他们完成了一些生物化学研究，另外交联质谱的工作则由爱丁堡大学的Juri Rappsilber博士实验室完成。

生物通：最新研究发现了ORC、Cdc6等组成的14个蛋白组合体结构，这一结构的特点是什么？相比于之前发现的结构具有哪些相同之处和不同之处呢？

李教授：这项工作最重要的发现是揭示了Mcm2-7如何通过ORC-Cdc6加载到原始DNA上的。整个装载过程是由装载机（ORC-Cdc6）和Mcm2-7中都发现的所谓翼型螺旋结构域（WHD）介导的。ORC-Cdc6中的几个WHD结构在装载过程中是与Mcm2-7的WHD相互锁定的。

我们还以近原子的分辨率获得了与起始DNA结合的ORC-Cdc6的结构，这是OCCM结构的一部分。一直以来科学家们都知道酵母ORC具有识别复制起点某些特殊序列的能力，但ORC如何做到这一点依然是个谜。我们的结构揭示出ORC的一个亚基Orc4具有特殊的插入α-螺旋，这种螺旋可以滑入DNA双链的主槽中，从而令ORC原始序列具有识别能力。在ORC-Cdc6召集Mcm2-7的时候，它处于激活状态。另外一个实验室曾于Nature发表了fly ORC（2015）的晶体结构，那个结构处于非激活状态，因为fly ORC既不能与结合DNA兼容，也不能与负载因子Cdc6兼容。

最近，冷泉港实验室的Leemor Joshua-Tor实验室在eLife（2017）与我们合作发布了人类的ORC结构。我们的酵母ORC结构与人类ORC结构非常相似。

此外，我们的这项研究还揭开了Cdt1的神秘面纱，Cdt1是一种负载因子，但它在加载过程中的作用一直是一个谜。我们惊讶的发现Cdt1能形成了一个三结构域结构，并且支撑三个Mcm亚基：Mcm2，Mcm4和Mcm6。有趣的是，其中一个Cdt1结构域向上，能清除与ORC-Cdc6相互作用的Mcm2-7的末端。因此我们认为Cdt1能帮助准备Mcm2-7，其准备好与ORC-Cdc6的加载。

生物通：此外，能给我们介绍一下您的研究组吗？比如主要的研究方向，近期的研究成果等等。

李教授：多年来，我都在纽约州立大学石溪分校，以及布鲁克海文国家实验室工作，去年8月我将我的实验室搬到了文安德尔研究所。我的研究重要的一环就是低温仪器，文安德尔研究所是一家私人生物医学研究机构，最近刚建立了世界级的低温冷冻电镜设施。

我们实验室致力于真核生物中的DNA复制研究，我们还与其他DNA复制生物学家合作，研究复制叉上的解旋酶功能。关于这个内容，我们最近也发表了一篇PNAS文章（2017年1月）。

作者简介：

Huilin Li, Ph.D

Huilin Li is an internationally recognized structural biologist with more than 20 years of experience in cryo-electron microscopy (cryo-EM). His current work focuses primarily on the structural basis of DNA replication, the bacterial proteasome system and regulation and modification of the Notch receptor.

Dr. Li earned his Ph.D. in electron crystallography from the University of Science and Technology Beijing, where he trained with the late Prof. K.H. Kuo. He then completed postdoctoral research in the labs of Dr. Bing Jap and Dr. Kenneth Downing at Lawrence-Berkeley National Laboratory, where he studied membrane channels and microtubule structure by cryo-EM. From there, he joined Brookhaven National Laboratory as an associate biophysicist, rising through the ranks to attain a tenured position. In 2010, he joined Stony Brook University as a professor in the Department of Biochemistry and Cell Biology while also maintaining a summer appointment at Brookhaven. He is now a professor in Van Andel Research Institute’s Center for Epigenetics.

原文摘要：

Structural basis of Mcm2–7 replicative helicase loading by ORC–Cdc6 and Cdt1

To initiate DNA replication, the origin recognition complex (ORC) and Cdc6 load an Mcm2–7 double hexamer onto DNA. Without ATP hydrolysis, ORC–Cdc6 recruits one Cdt1-bound Mcm2–7 hexamer, thus forming an ORC–Cdc6–Cdt1–Mcm2–7 (OCCM) helicase-loading intermediate. Here we report a 3.9-Å structure of Saccharomyces cerevisiae OCCM on DNA. Flexible Mcm2–7 winged-helix domains (WHDs) engage ORC–Cdc6. A three-domain Cdt1 configuration embraces Mcm2, Mcm4, and Mcm6, thus comprising nearly half of the hexamer. The Cdt1 C-terminal domain extends to the Mcm6 WHD, which binds the Orc4 WHD. DNA passes through the ORC–Cdc6 and Mcm2–7 rings. Origin DNA interaction is mediated by an α-helix within Orc4 and positively charged loops within Orc2 and Cdc6. The Mcm2–7 C-tier AAA+ ring is topologically closed by an Mcm5 loop that embraces Mcm2, but the N-tier-ring Mcm2-Mcm5 interface remains open. This structure suggests a loading mechanism of the first Cdt1-bound Mcm2–7 hexamer by ORC–Cdc6.