中国学者最新Nature Biotechnology发表Cas9变体单碱基编辑新成果

　　

生物通报道：来自中科院遗传与发育生物学研究所等处的研究人员发表了题为“Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9- cytidine deaminase fusion”的文章，利用Cas9变体（nCas9-D10A）融合大鼠胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI），构成了高效的植物单碱基编辑系统nCas9-PBE，成功地在三大重要农作物（小麦、水稻和玉米）基因组中实现高效、精确的单碱基定点突变。

这一研究成果公布在2月27日的Nature Biotechnology杂志上，文章的通讯作者是遗传与发育生物学研究所高彩霞研究员，作为一位植物生物学家，高彩霞研究员曾利用旧技术制造了82种基因的突变，之后其研究组开始采用席卷世界各地生物学实验室的技术——CRISPR–Cas9来从事基因编辑研究，曾在六倍体面包小麦中成功实现了同时编辑3个同源等位基因 ，并由此赋予了小麦对白粉菌的遗传性抵抗力。去年在Nature杂志的“Science stars of China”（中国科学之星）一文中详细介绍了其研究组的工作。文章的第一作者为高彩霞研究组的博士生宗媛和王延鹏。

单核苷酸点突变是作物许多重要农艺性状发生变异的遗传基础。单碱基的变异会导致氨基酸替换或蛋白质翻译终止,使基因功能发生改变，从而有可能产生优良的等位基因与优异性状。传统诱变及单碱基突变筛选技术（如TILLING）需要进行基因组规模的筛选，耗时、耗力且鉴定到的点突变数目和种类有限。

基因组编辑技术，特别是基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术，可以在基因组靶向位点处产生DNA双链断裂（DSB），以人为提供的外源供体DNA为模板，通过同源重组（HR）介导的DNA修复途径来实现对目标基因的单碱基突变。然而，植物中同源重组效率目前非常低，很难以此实现高效的、稳定的单碱基突变。因此，植物育种和基因功能研究迫切需要新技术来提高基因组单碱基定点突变的效率，以实现基因功能与农艺性状的定向改良。

在最新这篇文章中，研究人员借鉴哺乳动物单碱基编辑方法，高彩霞研究组利用Cas9变体（nCas9-D10A）融合大鼠胞嘧啶脱氨酶（rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂（UGI），构成了高效的植物单碱基编辑系统nCas9-PBE，成功地在三大重要农作物（小麦、水稻和玉米）基因组中实现高效、精确的单碱基定点突变。

研究人员通过在原生质体中对报告基因BFP以及三种作物中五个内源基因七个位点突变结果的详细分析, 发现nCas9-PBE可实现对靶位点DNA的C至T替换，C碱基脱氨化的窗口覆盖靶序列的7个核苷酸（距离PAM远端的第 3-9位）；其中单个C的替换效率为0.39-7.07%，多个C的替换效率高达12.48%。

通过进一步的遗传转化，研究人员利用该体系获得了靶标区域单碱基替换的小麦、水稻和玉米突变植株，突变效率最高可达43.48%。nCas9-PBE技术无需在基因组的靶位点产生DNA双链断裂（DSB），也无需供体DNA的参与，具有简单、广适、高效的特点。nCas9-PBE单碱基编辑系统成功建立和应用，为高效和大规模创制单碱基突变体提供了一个可靠方案，为作物遗传改良和新品种培育提供了重要技术支撑。

高彩霞近年取得的重要研究成果：

2014年，中科院遗传与发育生物学研究所的高彩霞研究员与中科院微生物研究所的邱金龙研究员合作，利用TALEN和CRISPR-Cas9技术，在六倍体面包小麦中成功实现了同时编辑3个同源等位基因（homoeoallele） ，并由此赋予了小麦对白粉菌（powdery mildew）的遗传性抵抗力。这一突破性的成果发表在Nature Biotechnology杂志上（Nature子刊：中科院利用CRISPR及TALEN技术获基因组编辑新突破 ，中科院成果入选Nature Biotechnology二十年精品论文 ）。

2014年9月18日，高彩霞研究员在《Nature Protocols》杂志上发表了一篇题为“Genome editing in rice and wheat using the CRISPR/Cas system”的文章，详细描述了利用CRISPR/Cas系统分步实现水稻和小麦基因组编辑的一种实验方案（中科院Nature子刊发表CRISPR新文章）。

2015年，高彩霞研究组利用新近在细菌中发现的适应性免疫系统（CRISPR/Cas）特异识别病毒和外源DNA的特性，将该CRISPR切割系统引入植物，在植物中建立了这套DNA病毒防御体系。该研究成果发表在Nature Plants上（中科院学者Nature Plants利用CRISPR系统解析DNA病毒 ）。

高彩霞简介：

女，研究员，博士生导师

1991年获甘肃农业大学学士。1994年获甘肃农业大学硕士。1997年获中国农业大学博士。1997-1998年丹麦DLF-Trifolium公司科研部博士后。1998-2009年丹麦DLF-Trifolium公司科研部Research Scientist，课题组长。2009年9月回国，在遗传发育所植物细胞与染色体工程国家重点实验室任研究员，课题组长，2010年入选中国科学院“杰出技术人才”。

主要研究领域：农作物基因组定向编辑技术体系的研究与应用、农作物遗传转化技术体系的建立与应用，以及小麦重要功能基因的分子生物学研究。

原文摘要：

Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9- cytidine deaminase fusion

Targeted base editing in plants without the need for a foreign DNA donor or double-stranded DNA cleavage would accelerate genome modification and breeding in a wide array of crops. We used a CRISPR–Cas9 nickase-cytidine deaminase fusion to achieve targeted conversion of cytosine to thymine from position 3 to 9 within the protospacer in both protoplasts and regenerated rice, wheat and maize plants at frequencies of up to 43.48%.