朱斌教授PNAS文章：首个不需引物的DNA聚合酶

　　

生物通报道：长久以来公认DNA聚合酶不能仅以核苷酸底物从头合成DNA，必须要在一段特定长度的DNA或RNA引物末端开始聚合DNA。而来自华中科技大学，哈佛大学，日本地球海洋科技局的研究人员近期发现了自然界已知的第一个不需要引物的DNA聚合酶，这不仅在聚合酶进化研究中有重要意义，而且还蕴藏了在核酸合成和测序技术中的应用价值。

这一研究成果公布在3月7日的《美国国家科学院院刊》（PNAS）杂志上，文章的通讯作者为华中科技大学朱斌教授，朱教授研究组主要致力于发现新颖奇特的微生物核酸代谢酶并开发相关的核酸生物技术和工具酶。尤其关注海洋中的新颖微生物及其核酸代谢酶，课题视角独特，自由度大，基础与应用并重。

作为遗传信息准确传递的最重要分子，DNA聚合酶一向是分子生物学研究的热点，也是生物技术的明星分子（PCR、DNA测序等技术的核心工具）。长久以来公认DNA聚合酶不能仅以核苷酸底物从头合成DNA，必须要在一段特定长度的DNA或RNA引物末端开始聚合DNA。

在最新文章中，研究人员从一种新发现的海底火山病毒中找到一种独特的DNA聚合酶，它与任何已知DNA聚合酶都没有同源性，却能识别特定的模版序列，在没有引物的情况下专一性的用脱氧核糖核苷三磷酸从头合成DNA。这一特点不仅在聚合酶进化研究中有重要意义，而且还蕴藏了在核酸合成和测序技术中的应用价值。后续的生化、结构和应用研究还在进行中。

作者指出，海洋中的微生物是地球上最大的新颖基因和蛋白质的宝库，海洋生物学可以说是另一种生物学，像这样打破常规认识的发现可以期待在海洋中还会层出不穷。

最近高校创新性成果不断，如中科院-马普计算生物学研究所的研究人员发现大量的环形RNA可作为信使RNA来编码蛋白，这些环形信使RNA通过一种常见的RNA甲基化修饰m6A，来驱动非帽依赖性的翻译机制来合成蛋白质。尽管不排除很多环状RNA仍可能是非编码RNA，但新结果证明其中一大部分可以像信使RNA一样翻译成蛋白。这一发现模糊了编码和非编码RNA的界定。“****”学者Cell Res：环形RNA也能编码蛋白

另外，第三军医大学的研究人员设计了一种快速、准确且多功能的纸基血液检测方法，这种低成本的新检测方法将有可能成为资源有限情况下（如在战区、偏远地区及在紧急情况时）理想的检测方法。第三军医大学发表Science子刊封面文章：几秒钟鉴定血型

Q&A

生物通：我们知道DNA聚合酶需要引物而RNA聚合酶不需要，是因为遗传物质保守性的问题，那么为何这种噬菌体不需要呢？是否体内有其它机制呢？

朱教授：DNA聚合酶反应需要单链DNA模版，四种脱氧核糖核苷三磷酸底物，镁（锰）离子，和一段一定长度杂交于DNA模版上的引物（DNA或RNA）。在PCR中引物一般是一段合成的DNA，而在体内则一般是由另一类特殊的聚合酶“引发酶－primase”合成的一小段RNA。关于引物的必需性，一般认为对一个聚合酶来说，从头聚合几个最初的核苷酸并将其稳定在DNA模版上不解离需要其与模版的强结合，而对已经和模版DNA结合稳定的新生DNA链的快速延伸则不能有如此强的结合，对一个酶活性中心来说这两者是矛盾的。因此自然设计了两类聚合酶分别完成这两步，相应的，DNA聚合酶不能从头合成但有着很强的延伸性和速度，而引发酶可以从头合成但反应很慢而且延伸性较低，一般合成几个到十几个核苷酸就会从模版上解离。从功能上讲，这个酶体现了最简单的生命形式－噬菌体的高效和简洁，它以一个较小的蛋白质将引发酶和DNA聚合酶功能集于一身，并且表现出自然界另一大类聚合酶－DNA依赖的RNA聚合酶的特点。它识别DNA模版上的一段8核苷酸序列专一性的用脱氧核糖核苷三磷酸从头起始DNA合成（引发酶一般用核糖核苷三磷酸），在完成最初的5核苷酸合成后经历一个较大的构像变化从起始模式转为经典DNA聚合酶的延伸模式，转换过程中会释放出较多2－5个核苷酸长度的中断产物，这一特点与RNA聚合酶释放启动子类似。因此可以说它结合了自然界三大类聚合酶的特点。

生物通：这种不需要引物的DNA聚合酶具体是如何复制DNA的呢？

朱教授：它识别DNA模版上的一段8核苷酸序列专一性的用脱氧核糖核苷三磷酸从头起始DNA合成，在完成最初的5核苷酸合成后经历一个较大的构像变化从起始模式转为经典DNA聚合酶的延伸模式，转换过程中会释放出较多2－5个核苷酸长度的中断产物。这种起始－转换－延伸的模式与RNA聚合酶相似，但RNA聚合酶是在双链DNA模版上合成RNA，DNA聚合酶是在单链DNA模版上复制DNA。

生物通：除了不需要引物，这种DNA聚合酶还具有其它不同之处吗？

朱教授：除了在延伸DNA链这个基本功能上相似，这种DNA聚合酶与已知DNA聚合酶没有任何相似之处，它不具备经典的DNA聚合酶的结构特征－手形结构。它在自然界中能找到的唯一的略微相似的蛋白质是古细菌的引发酶，而相似度也只有几个氨基酸，而且它没有引发酶的特征锌指结构。

生物通：噬菌体的DNA聚合酶已经被用于了市场上的一些试剂产品中，比如T7 DNA聚合酶，您认为这种新的DNA聚合酶未来是否可以用作工具酶，还需要哪些进一步的研究？

朱教授：一个全新的酶从发现到应用要经过漫长的历程和详尽的解析。就拿您举例的T7 DNA聚合酶来说，它就是在我博士后导师哈佛大学的Charles C. Richardson实验室被发现和开发成工具的，这个酶发现于1971年，但到了1987年在我师兄Stanley Tabor手上才成为了第一代测序酶“Sequenase”，使DNA测序效率提高了几十倍，大大的加速了人类基因组计划的完成。没有这十几年间数十篇论文工作的详尽研究把这个酶的所有细节甚至细到纯化时的EDTA浓度都搞清楚是不可能有如此有效的应用。而后来Stan并没有满足于测序酶的成就，他再接再厉详细地分析了T7 DNA聚合酶与其它A类DNA聚合酶的差异，发现活性口袋一个氨基酸上一个羟基的变化就是能影响测序效率几千倍的关键决定因素，由此改造后的Taq DNA聚合酶成为二代的“Thermo sequenase”，立即风靡了整个测序界，但时间已经到了1995年，又经历了漫长艰辛的基础研究。

时至今日不管测序技术多么日新月异，只要用到DNA聚合酶，就要根据测序酶对活性位点进行改造。测序酶因此成为哈佛大学历史上收益最多的专利之一，也给我开展“冷门”的研究提供了最早的资助。不仅是测序酶，所有现在的流行工具酶都经过这样漫长的研究历程才成为可靠的工具。最近风靡的CRISPR也是一样，早期的CRISPR工作并未引起广泛关注，大家都比较关注实现应用的临门一脚，其实前期众多科学家坚实的基础研究工作也是后来开展应用的关键。总而言之，DNA聚合酶作为生物技术的明星分子，任何新颖的DNA聚合酶都有着被应用的潜力，但在它的所有性质被研究清楚之前谈论应用还为时过早。我们课题组正在开展后续的生化研究，包括对DNA聚合酶的重要性能参数专一性、延伸性、底物特异性的定量研究。同时还与合作者进行结构解析，这对理解酶的反应机理以及今后可能的酶的改造也是非常重要的。不过我认为对于基础研究工作者来说弄清未知事物本身是最重要的，真正突破性的发现是不可能在研究早期就被预见的，如果能的话那就不会是一个真正的大发现。

（生物通：张迪）

作者简介：

朱斌

职称职务 教授、博士生导师
学科专业 微生物学、生物化学、生物技术

教育经历 09/1998-06/2002: 厦门大学 生物学 学士
09/2002-06/2007: 中科院上海生化细胞所 生物化学与分子生物学 博士
工作经历 09/2007-03/2016:哈佛大学医学院 博士后
03/2016-至今:华中科技大学 教授
学术兼职
研究方向 主要致力于发现新颖奇特的微生物核酸代谢酶并开发相关的核酸生物技术和工具酶。尤其关注海洋中的新颖微生物及其核酸代谢酶，课题视角独特，自由度大，基础与应用并重。欢迎具有微生物学、生物化学和生物技术相关背景和研究兴趣的人才加盟。

近年的科研项目、专著与论文、专利、获奖
2016年入选第十二批“****”青年项目
2016年国家自然科学基金 31670175 新颖噬菌体转录体系的解析及应用
2015年国际专利 WO 2015024017 RNA polymerase, methods of purification and methods of use
2015年科技部教育部春晖杯海外留学人员创新创业大赛一等奖
2006年IUBMB青年科学家奖

原文标题：

Deep-sea vent phage DNA polymerase specifically initiates DNA synthesis in the absence of primers