癌症研究经验谈1:新一代测序是生物标志物发现的无价之宝

【字体: 时间:2017年03月02日 来源:生物通

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  现在,我们来聚焦一些顶尖的科学机构,看看他们如何利用新工具来改善癌症的诊断和治疗。Georges-François Leclerc中心的实验室研究人员利用MiSeq®和NextSeq® 500系列来开展RNA-Seq、ChIP-Seq和外显子组测序,以搜索与癌症相关的基因表达谱。

引言

基因组学已经改变了生物医学的各个领域,但DNA测序对任何领域的影响都没有癌症研究那么深远。科学家们聚焦肿瘤,确定看似相同的癌症之间那些细微和不那么细微的差异,深入了解什么引起了癌症,以及它们如何响应不同类型的治疗。Romain Boidot博士作为Georges François Leclerc中心(CGFL)的实验室主任,已成为数百名科学家和临床研究人员的测序资源。

自2012年以来,Boidot博士和CGFL在癌症研究中依赖Illumina的新一代测序(NGS)系统。他们从MiSeq系统开始,开展转录组测序(RNA-Seq)、染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq),并利用基因集合来鉴定实体瘤。2015年1月,他们又增加了NextSeq 500系统,以便获得更高的产量和开展更深度的测序。他们现有的项目之一是对乳腺癌基因表达的生物标志物进行分类,高效描述实体瘤,其希望是影响治疗和预后。

iCommunity最近与Boidot博士对话,深入了解CGFL开展的癌症研究,以及如何利用MiSeq和NextSeq 500系统开展RNA-Seq、ChIP-Seq和外显子组测序,使其研究人员能够发现癌症的生物标志物。

Romain Boidot博士是法国Georges François Leclerc中心(CGFL)的实验室主任。

Q:CGFL正开展哪些类型的基因标志物研究?

Romain Boidot(RB):我们研究癌细胞,也研究免疫细胞特异的基因。我们利用RNA-Seq来检测哪种类型的免疫细胞或T淋巴细胞亚型浸润了肿瘤。RNA-Seq的好处在于我们能研究肿瘤细胞,以及形成肿瘤微环境的细胞。我们正准备开始一个新项目,来鉴定免疫治疗反应的特定标志物,这个项目包含30-40名癌症对象。

Q:您最初如何将NGS整合到您的实验室研究中?

RB:首先,我们想利用癌症基因集合来研究样本。我们是法国第一批购入MiSeq系统的机构。我们需要时间来熟悉这个系统,了解工作流程,并确定哪种文库制备技术更好地支持我们的研究。在开展了6个月的DNA测序之后,我们决定试试RNA-Seq。2013年初,我们开始在MiSeq系统上开展RNA-Seq。

Q:您曾在MiSeq系统上开展哪些类型的测序项目?

RB:最初,我们利用MiSeq系统进行一些常规工作,通过含有BRCA和同源重组基因的癌基因集合来研究乳腺癌和卵巢癌的易感性。

Q:是什么激励您在2013年初转向RNA-Seq?

RB:第一次RNA-Seq运行是在免疫学研究项目中开展的,它包括一项T-CD4淋巴细胞的分化研究1。我们最终有2个项目,是利用MiSeq系统开展RNA-Seq运行,它们进展得非常顺利。我们又购入了NextSeq 500系统,因为它能够在每次运行中带来更高的产量和更多的序列。

Q:您目前在NextSeq 500和MiSeq系统上开展哪些类型的研究?

RB:MiSeq和NextSeq 500系统之间存在着协同效应。我们是根据序列来源的大小以及样品数量来做决定的。在NextSeq 500系统上,我们开展常规的外显子组研究以便进行多学科的分析,以及RNA-Seq和ChIP-Seq。我们也利用它分析基因集合,特别是当我们有一个大的样本队列时。我们将在NextSeq 500系统上运行一堆样本,而不是在MiSeq系统上开展多次运行。

我们通常在MiSeq系统上开展基因集合的测序。我们从癌基因集合和几组癌基因开始,如今在使用体细胞基因集合。

Q:NextSeq 500系统的优势有哪些?

RB:主要优势在于读取深度。对于MiSeq系统,我们能获得1200-1500万条序列。而在NextSeq 500系统上运行,我们将读取深度提升至4亿条序列。

NextSeq 500系统降低了每次分析的成本,因为大量样本可被多重分析,以获得比MiSeq系统更高的深度。这增加了我们能够开展的RNA-Seq项目数量。更快获得结果也是一个明显的优势。

“我们又购入了NextSeq 500系统,因为它能够在每次运行中带来更高的产量和更多的序列。”

Q:MiSeq和NextSeq 500系统在数据质量上有何差异?

RB:我们利用两台仪器都获得了高质量的数据,真让人开心。数据质量支持我们的基础和转化研究。NextSeq 500系统上的RNA-Seq读取深度高得多,为我们提供了更多信息。我们目前正在比较MiSeq和NextSeq 500系统上的癌基因集合测序结果,应该很快会有结果。

Q:您花了多久才开始常规使用NextSeq 500系统?

RB:NextSeq 500系统的安装非常顺利。我们几乎马上就开始用了。NextSeq 500系统上的第一个测序运行是RNA-Seq,结果很强劲。此系统在2015年1月送达,在3月中旬投入运行,而在2015年6月,我们开始常规开展RNA-Seq。之后,我们开始进行ChIP-Seq和外显子组测序。

在了解如何操作系统时,我们的大部分时间花在文库制备。我们意识到,通过调整浓度,我们可以获得最佳的簇数量,并充分挖掘测序能力。

我们也必须学习如何设置软件的测序运行。我们使用BaseSpace® Onsite Server*,它包含Prep Tab软件,帮助将文库集合组织成测序运行。

* 自2016年4月起,BaseSpace Onsite Server改名为BaseSpace Onsite Sequence Hub。

Q:BaseSpace Onsite对您的测序管道有何影响?

RB:我们需要向CGFL的研究人员展示,我们了解并且能够开展测序,对他们来说具有真正的附加值。BaseSpace Onsite及管道分析,无论是Burrows-Wheeler Aligner(BWA)还是Isaac™ 比对软件,都让我们能利用NextSeq 500系统运行外显子组。如果我们没有BaseSpace Onsite,我认为我们不能快速运行外显子组流程,并实现这种质量。

Q:来自单一供应商的全面流程带来了哪些好处?

RB:与1名供应商打交道,让我们在排查故障时,只有单个接触点。全面的流程为我们提供了分析连续性。它让我们在整个过程中感觉舒适,并帮助我们获得高质量的结果。

“BaseSpace Onsite及管道分析,无论是BWA还是Isaac,都让我们能利用NextSeq 500系统运行外显子组。”

Q:NextSeq 500系统对临床研究而言有何价值?

RB:如今,我们在NextSeq 500系统上运行所有的临床研究样本。我们选择这个系统,是因为它让我们能够开展多个样本的外显子组和集合测序,对外显子组大小而言足够了。我们的临床癌症研究主要是在对象同意时研究可应用的生物标志物,这让我们能够发现文献中没有的生物标志物。

Q:Illumina的客户支持是否有帮助?

RB:Illumina的客户支持非常棒。当他们出现时,我们提出一些问题,而他们都能快速解决。

“如今,我们在NextSeq 500系统上运行所有的临床研究样本……因为它让我们能够开展多个样本的外显子组和集合测序,对外显子组大小而言足够了。”

Q:NGS是否改变了您研究中所使用的癌基因集合类型?

RB:NGS让我们能够获取那些十分强大且前沿的研究工具,它帮助扩大我们研究的影响力。在使用Sanger测序时,我们测序BRCA1和BRCA2集合。而有了NGS,我们的集合不仅包括BRCA1和BRCA2,还包括与乳腺癌以及消化道癌症的易感性相关的23个其他基因。通过使用这些集合,我们已经认识到,这些基因不仅是乳腺癌和卵巢癌易感性的研究对象,可能对消化道癌症的易感性也有影响,反之亦然。

Q:对于您的研究,下一步打算做什么?

RB:下一步是继续开展外显子组测序,并鉴定出靶向免疫治疗以及传统化疗的新型生物标志物。我们也希望开发出集合,让循环DNA变异的分析成为可能。NextSeq 500系统将实现这些研究,因为它带来了更高的读取深度,让我们能够确定信息阈值。我们还将利用RNA-Seq来研究石蜡包埋肿瘤组织的融合基因和变异。

Q:您是否想到过,这些进展可通过NGS来实现?

RB:在我做毕业论文的时候,Sanger测序是唯一的技术。当我回到CGFL开始两年的工作时,前景并没有改变。之后我去参加一个跨学科的会议,听到人们谈论什么将会随着Illumina NGS系统而出现。当我们看到一台送往欧洲的MiSeq系统时,我们意识到,它将让我们的研究增值。我从来没想过用MiSeq系统能做这么多事,NextSeq 500系统也一样。

深入了解本文提及的Illumina测序系统

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