在miRNA测序中,别让接头二聚体和污染性RNA偷走了您的序列……[新品推荐]

【字体: 时间:2017年04月11日 来源:生物通

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  尽管NGS是发现新miRNA的默认工具,但市面上的文库制备试剂盒很繁琐,会引入偏向。因此,qPCR一直是定量miRNA表达的首选技术。如今,QIAseq miRNA Library Kit重新定义了小RNA测序产品,包含了其他测序试剂盒没有的一些独特功能。

成熟的miRNA是天然存在的非编码RNA,大小约为22个核苷酸,介导了转录后基因调控。miRNA的改变与发育、分化、信号转导、感染、衰老和疾病中的基因表达变化相关联。不断增加的证据表明,循环miRNA表达与正常和疾病生物学相关联——因为miRNA几乎在所有体液中表达,包括血清、血浆、脑脊液(CSF)和尿液。特别是癌症,许多研究和综述已经将各种miRNA的存在与癌细胞增殖、抗凋亡、侵袭和分化相关联。

miRNA表达的定量可通过多种技术开展,包括新一代测序(NGS)和实时定量PCR(qPCR)。尽管NGS是发现新的miRNA的默认工具,但市面上的文库制备试剂盒很繁琐,会引入偏向。因此,qPCR一直是定量miRNA表达的首选技术。如今,QIAseq miRNA Library Kit重新定义了小RNA测序产品,包含了其他测序试剂盒没有的一些独特功能。它将NGS的力量与UMI的单分子定量相结合,可以产生最具代表性的表达数据。

miRNA测序流程的一个突出问题是接头二聚体污染的存在。尽管跑胶可以去除接头二聚体和污染性RNA,但繁琐的样品处理不可避免会造成样品损失,并且即使在切除凝胶后,仍然存在着序列读取偏高的可能性。

QIAseq miRNA Library Kit全面优化了文库制备过程,不需要跑胶纯化、切胶和洗脱,避免了大量的样品处理/损失,也节省了时间。专利的寡核苷酸修饰几乎避免了接头二聚化,即使是极低的起始总RNA也不怕。此外,反应过程也有助于制备出消除偏向和背景污染的、稳定的miRNA文库。这些优势使得可测序的miRNA产量最大化。

由于循环miRNA有望作为生物标志物,QIAseq miRNA Library Kit经过了精心优化,可比对超低起始量的miRNA,适用于循环miRNA建库。此外,这个试剂盒将特异性分子条码(UMI)整合到逆转录过程中,通过NGS对成熟miRNA进行无偏向且准确的完整miRNA组定量。

上图显示,在经过一个包含磁珠纯化的基本操作之后,QIAseq miRNA表现出稳定的miRNA文库,不含接头二聚体或污染性RNA。与竞争试剂盒生成的文库相比(之前必须进行繁琐的凝胶切除),QIAseq带来的miRNA文库更加稳定,没有接头二聚体和污染RNA。

流程

首先利用miRNeasy试剂盒,从体液(如血清、血浆、脑脊液和尿液)、细胞、新鲜/冷冻组织或FFPE组织中提取出总RNA。之后,利用QIAseq miRNA Library Kit制备miRNA测序文库。

在一个无偏向的反应中,接头被依次连接到miRNA的3’端和5’端。随后,开展带UMI分配的通用cDNA合成、cDNA纯化、文库扩增和文库纯化。利用修饰寡核苷酸的专利方法几乎避免了测序文库中接头二聚体的存在,有效去除了测序过程中经常观察到的主要污染物。基于磁珠的纯化可清除掉大多数不想要的背景噪音,它们会浪费测序经费。在数据分析期间,UMI确保样品被特异分析,而不是扩增或测序假象。从样品到测序仪,整个过程只需8个小时,且手工操作时间很短。最多可对48个样品进行多重制备。

测序后,“.fastq”或“.fastq.gz”格式的文件可直接上传到GeneGlobe数据分析中心,进行初步的比对和分子标签计数。对于研究透彻的物种,如人类、小鼠和大鼠,序列可与物种特异的miRBase和基因组数据库比对。对于研究不多或新颖的物种,序列可与整个miRBase数据库比对。之后,可通过多种方法开展二次的差异表达分析,实现分子标签计数的均一化和生成数据的可视化。这,就是QIAGEN提供的一个真正的从样品分离到数据分析和解释(Sample to Insight)的流程。

应用

体液(如血清、血浆、脑脊液和尿液)、细胞、新鲜/冷冻组织,以及包含总RNA和miRNA的FFPE组织,都适合应用QIAseq miRNA Library Kit进行分析。利用QIAseq miRNA可鉴定下一个循环miRNA生物标志物;揭开FFPE组织中深藏的miRNA特征;鉴定全新种类miRNA。QIAseq miRNA Library Kit经过精心设计以提高体液(如血清)miRNA的产量,在图中展示了对血清样品中miRNA的强大检测能力。将比对的序列与接头二聚体处理血清样品的结果进行比较:即使样品有限,QIAseq miRNA仍表现出miRNA的出色比对。有了QIAseq miRNA Library Kit,您可确定任何已知或新miRNA的差异表达,适用于任何物种的任何总RNA样品。

无论是有着数百个样品的大型项目,还是关注一组目标miRNA的小型试验,QIAseq miRNA都是增强发现和表达的终极工具。QIAseq miRNA为利用新一代测序开展差异表达分析和发现新的miRNA,提供了一个前所未有的Sample to Insight解决方案。

立即索取QIAseq miRNA Library Kit的详细资料

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