如何利用数字PCR来验证基因组编辑的结果[创新技巧]

在CRISPR基因组编辑之后，工作并没有结束，你需要验证感兴趣的基因是否成功突变。目前有几种方法可供选择。新一代测序技术当然是金标准，但对于许多实验室而言仍然是高不可攀的，对于小型项目来说也是不切实际的。为此，加拿大阿尔伯塔大学的Scott Findlay引入数字PCR，作为新兴的验证技术。

数字PCR（dPCR）的原理相信大家都有所了解。它将样品分为成千上万个液滴，使得大多数液滴只包含一个目标DNA拷贝，或没有拷贝，之后利用PCR扩增目标。它不像实时定量PCR那样跟踪反应进程，而是在反应结束后评估每个液滴的阳性或阴性信号。通过统计建模可确定原始样品中目标DNA分子的实际数量。这意味着数字PCR可以对目标丰度进行绝对定量，而不需要标准曲线。

突变筛选

之后，Findlay介绍了如何利用数字PCR来进行突变筛选。其实，这与平常的实时定量PCR中的引物探针检测并没有太大的差异。这些分析可检测通过同源定向修复（HDR）整合的供体序列，或通过非同源末端连接（NHEJ）产生的插入缺失突变，具体取决于你的基因组编辑。

由于NHEJ的采用可产生改变翻译阅读框的插入缺失，将感兴趣基因的功能敲除，已成为基因组编辑最常见的应用之一，故Findlay详细介绍了NHEJ的检测（图1）。这些检测包括扩增目标位点的正向引物和反向引物，与未编辑位点结合的参考探针（离预测的双链断裂较远），以及直接与双链断裂位点结合的drop-off探针。

图1：数字PCR检测NHEJ诱导突变的示意图。A）双重引物探针检测。B）drop-off探针和参考探针通道中荧光的2D图像。图片来自Addgene。

数字PCR具有单分子分辨率，因此可根据突变状态对单个目标分子进行分类。drop-off探针与野生型的序列完美匹配，故不能检测突变目标。每个样品中突变型和野生型目标的数量可快速计算，这样就能量化基因组DNA样品的突变率。

数字PCR的优势

与人们常用的错配核酸酶检测相比，数字PCR检测具有几个明显优点。

• 灵敏度：不到20 ng的gDNA已足够用于分析。研究人员通常采用96孔板单个孔中的几千个细胞进行分析，而无需预先定量。相比之下，错配检测需要200-500 ng的纯化PCR产物。
• 检测限低：数字PCR可准确定量高背景下低水平的突变目标（低至20 pg或0.02%）。而错配核酸酶检测的检测限大约是5%的突变目标。
• 区分单等位基因和双等位基因突变的能力：数字PCR最突出的优点就是，在筛选目的基因的功能被完全敲除的克隆时，它们能够轻松地区分单等位基因和双等位基因突变。错配核酸酶检测在这一重要差异上则完全是“瞎”的。

现在，你也可以试试用数字PCR来验证你的基因组编辑。不过要记住，后续仍然需要DNA测序来确认突变的确切性质。最后说一句，祝你好运！（生物通 薄荷）

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