Western Blot实验中如何选择合理的均一化方法[创新技巧]

Western Blot 是分子生物学中研究蛋白的经典方法，被广泛应用于检测细胞或组织样本中蛋白的表达量或者修饰情况。随着文献发表的要求越来越高，传统的定性或者半定量已经无法满足研究者对于western blot高质量的数据要求，研究者更多的是追求Western Blot的重复性、定量的准确性。对于定量的准确性而言，均一化的选择就显得尤为重要。

Western Blot实验中的均一化分析，用以校正不同样本之间、不同泳道之间的差异，获得准确、可重复的Western Blot数据。常见的均一化方法包括：看家基因、总蛋白染色、信号蛋白（如磷酸化等蛋白修饰研究中信号蛋白）等均一化方法等。

*常用也是*经典的方法是用看家蛋白做内参进行均一化，看家蛋白又称管家蛋白，一般被认为在所有的组织中表达恒定且不受实验条件的影响，主要包括 Actin/Tubulin/GAPDH等，但是近年来越来越多的研究表明，在某些实验条件下，看家基因的表达会因不同类型的组织来源、不同的发育阶段、或不同的实验条件而变化。另外，用看家蛋白进行均一化需要注意信号饱和的问题，因为一般情况下看家基因表达丰度相对于目标蛋白丰度较高，两种蛋白可能存在不同的线性范围，为此实验人员往往需要调整上样量。因此在Western Blot实验中，用来进行均一化的内参是否合适，是否可以作为绝对定量的均一化的标准？是需要研究者首先在心中打个问号的。那么如何确定选择的内参是否合适？——LI-COR 提供的 Odyssey® Loading Indicators（OLI）可以帮助您解决这个问题。 Odyssey® Loading Indicators 是一个标记了 IRDYE 700/800近红外荧光染料的28KDa 的外源重组蛋白质，在电泳上样前与样品按照一定的比例混合上样，随后在western blot 结束之后可以实现在Odyssey 近红外激光成像系统上进行观察。通过外源加入的 Indicators 的荧光值可以判断不同泳道之间：a、上样的一致性；b、转膜效率的一致性；c、内参蛋白的表达是否可以作为均一化的标准。

接下来，我们通过两个实例来揭示Odyssey® Loading Indicators 是如何实现对内参蛋白是否可以作为均一化的标准进行判读的。 Figure 1. 显示实验中选取的 COX IV的内参在不同泳道上的表达与外源加入的OLI 是几乎一致的，在此实验中，COX IV可以作为均一化的标准，可以实现对目的蛋白pERK进行精确的定量。而 Figure 2. 中，经过Etoposide的刺激后，两种内参蛋白Tubulin 和COX IV 的表达都受到了影响，而不能作为该实验的均一化的标准。

Jurkat cells were treated with increasing amounts of TPA, stimulating the target pERK (Orange, 800 nm). OLI (Green, 800 nm) was used to assess the stability of expression of the housekeeping protein COX IV (Blue, 700 nm). Standard deviations for the triplicate values of each treatment are plotted as error bars. 实验数据来自LI-COR Biosciences

The housekeeping protein signal intensity was plotted, along with signal intensities of OLI and REVERT Total Protein Stain. Both (A) tubulin and (B) COX IV signals varied in response to treatment, while REVERT Total Protein Stain signals and OLI signals remained constant. These quantitative data indicate the expression of both housekeeping proteins was affected by Etoposide treatment. 实验数据来自LI-COR Biosciences

那么，针对内参蛋白不能作为均一化的情况下，该如何进行均一化操作呢？ LI-COR也给出了更合理的解决方案——总蛋白染色 REVERT™ Total Protein Stain。LI-COR  REVERT™ Total Protein Stain方法是对膜上总蛋白进行染色，并且染液与蛋白之间是可逆结合，所以不会影响后续抗体结合，不干扰Western Blot的检测，*终可在Odyssey近红外荧光系统的 700nm 通道上检测，成像背景较低，灵敏度较高，因此能够校正Western Blot的所有步骤。

REVERT™ Total Protein Stain 作为均一化的标准与内参蛋白相比具有如下优势：首先， REVERT™ Total Protein Stain可以适用于任何的生物条件下，消除了不同生物条件下内参蛋白表达不恒定的影响；其次，消除了内参蛋白Stripping或者跑两块胶带来的变异差异；另外，内参蛋白一抗的批间差异也会造成实验结果的重复性问题，而总蛋白染色则避免这一问题。

与其他总蛋白染色方法相比，REVERT™ Total Protein Stain 也具有很明显的优势，例如普通的考马斯亮蓝染色，是不可逆染色，往往需要同时跑两块胶，一块胶进行染色另一块胶进行后续免疫试验，存在不能校正转印差异的问题，而REVERT™ Total Protein Stain 则是在PVDF/NC膜上进行可逆染色；虽然丽春红染色是可在膜上进行总蛋白染色，但丽春红染色的灵敏度和线性范围与REVERT™ Total Protein Stain 则相差很远，不能作为精确定量的均一化选择； Stain Free等染料，是对胶上或膜上总蛋白进行染色，但由于其与蛋白是共价不可逆结合，因此可能会影响抗体与靶蛋白的结合，并且在膜上的背景较高、线性范围也比较窄，而且需要特制的预制胶，增加了实验成本，而REVERT™ Total Protein Stain 则是可逆反应，不影响后续抗体结合，非常容易实现在Odyssey系统上的双指标同时定量，并且不需要改变原有的实验条件和实验体系，是一种既经济又准确的均一化方法。

综上，不论选择哪一种均一化方法，目的都是为了得到准确的可重复的实验数据。而不同的均一化方法也各有各的特点，了解每种均一化方法的特点，选择符合您实验目的、生物学条件的均一化方法，以校正不同样本之间的差异，才有可能得到高质量数据。小编为您介绍的两种LI-COR 提供的解决方案Odyssey® Loading Indicators（可以帮助您对内参蛋白的均一化标准进行判读）或者 REVERT™ Total Protein Stain （总蛋白染色均一化）都可以帮助您在Odyssey近红外激光成像系统上实现目标蛋白的准确定量。

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