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腺相关病毒(AAV)在动物实验中的应用

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年5月12日 来源:赛业生物

摘要:

  腺相关病毒血清型众多(12种),不同血清型对不同组织亲和性不同,因此在具体科学研究中,以下问题往往困扰着广大科研工作者:选择何种血清型?如何注射?注射多少病毒?注射部位如何选择?注射多久检测?本文就常见的注射部位和方法做一个简单的归纳,希望能够为大家提供一个概念和思路。

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腺相关病毒属于微小病毒科(parvovirus),为无包膜的单链线状DNA病毒,基因组大小约4.7kb。利用腺相关病毒可以将外源基因转入动物组织和细胞中,具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、表达稳定等多种优点,广泛应用于动物体内研究。

腺相关病毒血清型众多(12种),不同血清型对不同组织亲和性不同,因此在具体科学研究中,以下问题往往困扰着广大科研工作者:选择何种血清型?如何注射?注射多少病毒?注射部位如何选择?注射多久检测?本文就常见的注射部位(大脑、视网膜、肝脏、心脏和动脉、肺脏、肾脏、肌肉、肠)和方法做一个简单的归纳,希望能够为大家提供一个概念和思路。

一、大脑

大脑组织常用血清型有AAV1,AAV2,AAV5,AAV8和AAV9,其中神经组织常见的血清型有AAV2,AAV5和AAV8。对大脑组织而言,AAV5应用范围更广,AAV8更有效(值得注意的是,在猴子的神经组织中,AAV5更有效)。从作用效果上看,AAV8大于AAV1。

针对大脑组织不同部位,AAV不同血清型靶向性有所差异:
1) 海马组织:AAV9比AAV8更有效;
2) 神经组织不同的细胞,不同血清型靶向性不同:如神经元常用的血清型有AAV1、AAV2、AAV5和AAV9;星形胶质细胞和少突胶质细胞常用的血清型有AAV1和AAV5。

总体而言,在所有组织中,AAV2适用性最广并在脑部组织也有所体现,例如其可以达到大脑组织75%的区域。AAV2、AAV5、AAV8和AAV9也比较常见,应根据不同组织进一步慎重选择,在此介绍几种特例:

1、肠神经系统(Enteric Nervous System ENS),是由神经细胞组成的复杂网络,遍布整个肠胃消化管道。其神经元的数量和脊髓相当(约1亿个神经细胞)。该神经系统在人体躯干下部,属于迷走神经,以薄层的形式分布于消化肌之间,调节消化。常用AAV5、AAV6、AAV8 和 AAV9。AAV6对肠神经胶质和神经元有一定的靶向性。注射部位可以选择降结肠,注射量和滴度: 滴度为1.3 × 1012GC/ml的病毒注射5 μl即可,检测时间:注射后2周开始表达,2-6周均有检测。

2、脑组织常见的血清型为AAV9,注射方法:左心室注射或者侧脑室注射,注射剂量和滴度:选择滴度为0.5–4.0 × 1011GC/ml的病毒液,稀释成100μl,注射两周之后(14d)开始检测。下图为一些脑部组织注射情况:

Fig1. Transduction and phenotyping of transduced cells in the cerebral cortex

Fig2. Transduction of cells in the hippocampal formation.

Neuroscience 138 (2006) 501–510

Fig3. Transduction efficiency of recombinant adeno-associated virus (AAV) in the myenteric plexus (MP) of the enteric nervous system:a comparison across serotypes 1, 2, 5, 6, 8, and 9

Fig4. Neuronal tropism of recombinant adeno-associated virus (AAV) transduction in the submucosal plexus (SMP): serotypes 1, 2, 5, 6,8, and 9.

Molecular Therapy vol. 23 no. 3 mar. 2015

二、视网膜

视网膜组织常用血清型有AAV1、AAV2和AAV5。视网膜组织由于其特殊性,因而有自身的特点:注射成功率20-30%,容易造成视网膜炎症和损伤,注射完需要使用1%阿托品(和少量新霉素、多粘菌素B硫酸盐和地塞米松眼膏施用于眼睛,延长瞳孔扩张时间,减少腺体分泌,减少炎症反应),连续使用3-5d。其常用的注射量为0.5μl,病毒滴度1.5x107GC/ml。常用注射方法:视网膜下注射或者玻璃体注射。

但不同血清型又有不同特点:AAV1主要作用于视网膜上皮细胞,注射后2-4周可以检测;AAV2主要作用于感光细胞、视网膜上皮细胞和玻璃体,AAV2玻璃体注射后分布广泛,2-4周可以检测; AAV5可作用于视网膜上皮细胞和感光细胞,在感光细胞中表达AA5>AAV2,2-4周检测。下图为一些视网膜组织的注射情况:

Fig 5. AAV added to the retinal ganglion cell surface in culture vs. intravitreal injection in vivo.

Vision Research 48 (2008) 377–385

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