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看得见的蛋白互作新技术——Duolink PLA

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年5月24日 来源:默克中国

摘要:

  看得见的蛋白互作新技术Duolink® PLA® 加速了蛋白研究新发现。该技术可将蛋白信号放大1000倍,实现单分子级别的灵敏度。即便是微量样本、微弱互作、极罕见的低丰度表达,也能在内源水平可视化研究蛋白的互作、定位和定量。更关键的是该技术操作简单,仅需一天!

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现今,科技发展的齿轮正在高速运转,每隔2-3年就会出现一个重大的技术变革引领生命科学走向更精细、更微观、更真实的水平,这其中也包括蛋白的研究。在疾病的致病机理、分子机制、信号通路、药物筛选以及新型诊断标志物的发现中,传统的蛋白研究“金标准”方法如Co-IP、Western blot、ELISA、IF等已呈现出很大的局限性。

你可能在实验中遇到过以下问题:

WB方法灵敏度较低,无法检测低丰度、瞬时表达的蛋白;
Co-IP方法无法检测蛋白之间的微弱相互作用及间接相互作用;
蛋白过表达或融合标签后会改变其原有的功能,造成假阳性等结果;
非内源性表达,无法反应真实的状态,结果无说服力;
……

这表示,你目前使用的蛋白检测方法已无法满足研究所需的技术要求,是时候跟上蛋白研究技术变革的脚步,找到合适的新方法!看得见的蛋白互作新技术Duolink® PLA® 加速了蛋白研究新发现。该技术可将蛋白信号放大1000倍,实现单分子级别的灵敏度。即便是微量样本、微弱互作、极罕见的低丰度表达,也能在内源水平可视化研究蛋白的互作、定位和定量。更关键的是该技术操作简单,仅需一天

Duolink® PLA® 技术至今已在肿瘤学、神经生物学、免疫学、病毒学、表观遗传学、生殖发育、组织病理学、心血管、代谢等研究领域进行了广泛报道。下面针对不同方面的应用实例进行简单分享。

应用1:蛋白瞬时相互作用检测,解决Co-IP技术无法实现的应用

在肿瘤学研究过程中,很多蛋白的相互作用过程并不是稳定的,而是动态变化和瞬时产生的,下图是一篇肿瘤血管生成的研究,显示VEGF刺激前后的不同时间,Duolink PLA技术能够原位检测内皮细胞中VE-PTP与VEGFR2复合物的相互作用,每一个红点代表一个相互作用的复合物,蓝色代表细胞核。作者通过PLA技术发现VEGF以瞬时作用方式调控VE-PTP和VEGFR2复合物的形成,文章显示用传统的Co-IP方法无法检测VE-PTP与VEGFR2的相互作用。此外,由于PLA是细胞内源性水平检测,因此这种相互作用结果更加真实,作者也通过PLA技术发现了VE-PTP在血管生成中具有重要的功能。

应用2:微量细胞中的微弱蛋白互作检测,解决Co-IP技术无法实现的应用

在神经生物学研究中,很多时候研究的起始材料包括细胞、组织等非常微量,同时相互作用的蛋白也很微弱,超出了传统方法如CO-IP的检测灵敏度。DYX1C1是阅读障碍的易感基因,与神经元迁移有关,但并不清楚他们之间的功能与相关性。下图显示原代大鼠胚胎海马神经元使用雌二醇培养48h,PLA检测雌激素受体ERs/DYX1C1在神经突触中的相互作用(A,D为雌二醇(E2)刺激组,B,E 为未刺激组,C,F为无抗体阴性对照),每一个红点代表 ERs/DYX1C1相互作用的复合物,蓝色代表 Hoechst 染细胞核,绿色代表Actin蛋白。作者使用传统Co-IP方法并没有在胚胎神经元中检测到相互作用的复合物。通过PLA技术,对DYX1C1的功能有新的理解,发现了神经元迁移、阅读障碍与雌性激素信号通路的联系,从而影响脑发育,调节认知功能。

应用3:病理组织中蛋白相互作用的原位检测,解决IHC无法实现的应用

在肿瘤的靶向治疗过程中,BRAF是非常重要的药物靶点,很多肿瘤都存在BRAF(V600)的突变,很多药物都是针对这个位点,但是逐渐增加的药物抗性让大家迫切希望能够进一步发现新的药物靶标,和传统药物联合治疗,进一步提高药物治疗效果。下图是发表在Nature上的文章,从药物产生抗性的机理出发,针对抗性相关的信号通路中共同的复合物eIF4F,开发了PLA原位技术在细胞以及临床的病人病理组织样本进行大量的检测。下图显示与anti-BRAF治疗前的肿瘤相比,eIF4F复合物的形成比率在免疫应答的肿瘤中降低,在抗药性转移的肿瘤中复合物形成比率升高,图中每个棕色的点状信号代表一个相互作用复合体。因此eIF4F 能够作为先天(innate)和获得性(acquired)抗性的指示器,也能作为抗肿瘤治疗的靶标,通过封闭eIF4E–eIF4G相互作用或靶向 eIF4A,能够抑制eIF4F复合物的形成,从而协同抑制BRAF(V600),消除肿瘤细胞。PLA技术作为病理组织学研究的第二代新技术,在蛋白相互作用研究中具有高分辨率及精确性,是传统IHC实验无法实现的,能够建立高质量的病样组织标本库。

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