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RNA甲基化修饰(m6A)研究技术及方案设计

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年6月29日 来源:表观生物

摘要:

  m6A是一种动态可逆的修饰方式,在转录后调控中发挥作用,其在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译[1]等方面扮演重要角色,具有重要的研究意义。

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RNA 甲基化是表观遗传学内容的重要内容之一, 其中m6A(N6-methyladenosine,6-甲基腺嘌呤,化学结构见图1)较为常见的一种修饰方式。m6A是一种动态可逆的修饰方式,在转录后调控中发挥作用,其在调控基因表达、剪接、RNA 编辑、RNA 稳定性、控制mRNA寿命和降解、介导环状RNA翻译[1]等方面扮演重要角色,具有重要的研究意义(见图2)。


 
图1. 6-甲基腺嘌呤化学结构及可逆反应过程


 
图2. 动态修饰的m6A修饰及介导的生物学功能[2]

M6A甲基化修饰是由一个多蛋白复合物介导产生,目前已知这个复合物的成分包括METTL3,METTL14和WTAP;而负责擦除甲基化修饰基团的则由去甲基化酶FTO和ALKBH5所承担。在细胞核中的HNRNPC 负责识别m6A修饰基团,并介导mRNA前体的选择性剪接。而另外一个m6A识别蛋白HNRNPA2B1[3]则促进pri-miRNA加工成pre-miRNA。在细胞质中,不同的M6A位点识别蛋白介导不同的功能。YTHDF1和YTHDF3[4,5]识别 m6A修饰mRNA,通过与起始因子及核糖体相互作用促进蛋白质翻译,eIF3识别蛋白也会直接绑定到mRNA5’UTR端的m6A位点参与翻译起始。而另外一个识别蛋白YTHDF2与m6A识别将导致mRNA的降解。目前还存在其他未知的m6A识别蛋白,相关研究的继续开展将有利于解开m6A在mRNA运输、翻译和存储等功能的谜团。

虽然RNA甲基化的研究在上世纪七十年代就开始,但是由于技术上的局限一直停滞不前,直到最近几年在何川教授等团队的带领下,通过不断的技术创新和难点攻克,m6A等甲基化修饰的研究才不断取得突破性的研究成果。

关于m6A的研究方向,主要涉及m6A本身的修饰过程涉及的甲基化酶和去甲基化酶,以及m6A识别蛋白。这个研究方向的研究技术难度较大,涉及较多生化实验,慎入为好。其次是m6A修饰谱构建及作用机制,特别是构建疾病细胞模型或者发病组织的m6A修饰谱,涉及较为关键的MeRIP-seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing)高通量测序技术[6]。第三个方向是m6A修饰失衡介导相关基因异常(可变剪切、稳定性、翻译、miRNA调控)在所发挥的作用。第四个方向是通过大数据分析,利用公共数据资源对m6A修饰涉及的基因进行表达量统计,并进行共表达分析预测其可能调控的靶基因,进而进行功能验证。(见图3)


 
图3. m6A的主要研究方向

下面我们将重点介绍其中一种研究方向的设计思路,并提供相应的技术服务和解决方案。

研究方向:构建转录组m6A修饰图谱
研究目的:构建目标样本的m6A修饰谱,揭示在特定生命过程或者疾病模型中的m6A图谱。
实验样本:细胞、组织、提取后的总RNA(限定有参基因组物种)
关键技术:meRIP-seq (methylated RNA immunoprecipitation sequencing),也称m6A-seq

最近几年来m6A研究迅速发展,正是得益于meRIP-seq技术的开发及应用。meRIP-seq高通量测序技术的出现,能够高效精确检测全转录组不同的RNA 甲基化,是成功发现RNA 甲基化机理及功能的关键技术。

MeRIP-seq 技术将甲基化DNA 免疫共沉淀(methylated DNA immunoprecipitation, MeDIP) 技术、RNA 结合蛋白免疫共沉淀(RNA immunoprecipitation,RIP)技术和RNA 测序(RNA sequencing,RNA-seq) 技术组合起来,高精度地检测全基因组(或全转录组)范围内的RNA 甲基化。MeRIP-seq 技术采用免疫共沉淀方法,即甲基化RNA 特异性抗体与被随机打断的RNA 片段进行孵育,抓取有甲基化修饰的片段进行测序;同时需要平行测序一个对照(control)样本,对照样本用于消除抓取带有甲基化片段过程中的背景。然后将免疫共沉淀(IP)样本和对照样本中的序列片段对比(或定位)到参考基因组/ 转录组上,检测RNA 甲基化位点。对照样本测量对应RNA 的表达量,本质上是RNA-seq 数据(图4)[7]。


 
图4 .MeRIP-seq 技术检测m6A 技术流程[4]

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