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新手指南:如何规划我的CRISPR实验 [心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年6月9日 来源:生物通

摘要:

  CRISPR,这种新颖的基因组编辑技术凭借层出不穷的研究进展、热闹非凡的专利纷争,牢牢占据了各大杂志的头条。也许你也开始心动,希望尝一下“头啖汤”,但是纷涌而出的成果又让你不知从何下手。那么,现在就跟随我们,来规划一下你的CRISPR实验吧。

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话说生物圈这几年最火热的技术,绝对非CRISPR莫属。这种新颖的基因组编辑技术凭借层出不穷的研究进展、热闹非凡的专利纷争,牢牢占据了各大杂志的头条。也许你也开始心动,希望尝一下“头啖汤”,但是纷涌而出的成果又让你不知从何下手。那么,现在就跟随我们,来规划一下你的CRISPR实验吧。

首先,你要考虑一下为什么使用CRISPR系统。永远破坏基因表达或功能(敲除)?表达突变型的基因(点突变)?还是增加或减少目标基因的表达?一旦你心中有数,那么后面就好办了。

CRISPR用于哪方面?

不同的遗传操作需要不同的CRISPR组件。确定了你的用途,相应地也就缩小了实验试剂的范围。需要注意的是,尽管这里介绍的内容主要针对哺乳动物细胞,但是许多原则也适用于其他物种。如果你挑选不到完美的质粒,可尝试一下独家定制。

遗传操作

应用

Cas9

gRNA

其他考虑

敲除

永久破坏特定细胞或生物体中的基因功能

Cas9(或Cas9切口酶)

一条(或两条)gRNA,靶定5’ 外显子或重要的蛋白结构域

切口酶的方法提高特异性,但不够高效

编辑

在特定基因中生成用户指定的序列改变

Cas9(或Cas9切口酶)

一条(或两条)gRNA,靶定待编辑的区域

需要DNA模板进行同源指导修复。与敲除相比,效率有所降低

抑制

CRISPRi

降低特定基因的表达,而不永久修饰基因组

dCas9dCas9-抑制子(如dCas9-KRAB

gRNA靶定目标基因的启动子元件

对哺乳动物细胞系,dCas9-KRAB比单独的dCas9更加高效

激活

CRISPRa

提高特定基因的表达,而不永久修饰基因组

dCas9dCas9-激活子(如dCas9-VP64

gRNA靶定目标基因的启动子元件

目前有许多种不同的激活子

表达系统如何选?

CRISPR听上去并不复杂,只是在你的目标细胞中表达gRNA和Cas9。这个表达系统的选择就要取决于你的具体应用了。假如你的细胞比较容易转染,像HEK293细胞,那么标准的转染试剂可能就足以表达gRNA和Cas9。对于一些较难转染的细胞,病毒导入不失为一个好选择。下表总结了一些主要的表达系统。

表达系统

组件

应用

哺乳动物

表达载体

Ÿ   Cas9的启动子可以是组成型(CMVEF1α、CBh),也可以是诱导型(Tet-ON);U6启动子通常用于gRNA

Ÿ   许多载体包含报告基因(如GFP),以鉴定或富集阳性细胞;或包含选择标记,以生成稳定的细胞系

Ÿ   在可轻松转染的哺乳动物细胞系中瞬时或稳定表达Cas9/gRNA

慢病毒转导

Ÿ   Cas9gRNA放在一个慢病毒转移载体上,或分布在不同载体上

Ÿ   许多包含报告基因(如GFP)或选择标记,以鉴定和富集阳性细胞

Ÿ   包装和包膜的质粒为形成慢病毒颗粒提供了必要的元件

Ÿ   在各种哺乳动物细胞中稳定表达Cas9/gRNA

Ÿ   利用CRISPR/Cas9开展全基因组筛查的理想选择

AAV转导

Ÿ   只适用于SaCas9(包装容量约为4.5 kb

Ÿ   CRISPR元件可插入AAV转移载体中,产生AAV颗粒

Ÿ   瞬时或稳定表达SaCas9/gRNA

Ÿ   感染分裂和非分裂的细胞

Ÿ   AAV是毒性最小的方法,适合体内应用

Cas9 mRNAgRNA

Ÿ   包含gRNACas9的质粒可通过体外转录反应,产生成熟的Cas9 mRNAgRNA 然后导入目标细胞(显微注射或电穿孔)

Ÿ   CRISPR组件的瞬时表达

Ÿ   随着RNA的降解,表达降低

Ÿ   可用于生成转基因胚胎

Cas9-gRNA核糖核蛋白复合物

Ÿ   经过纯化的Cas9蛋白和体外转录的gRNA可形成Cas9-gRNA复合物,并利用阳离子脂质体导入细胞

Ÿ   CRISPR组件的瞬时表达

Ÿ   随着gRNACas9蛋白的降解,表达降低

重头戏来了!如何设计gRNA?

一旦你选好了CRISPR组件和导入方法,下一步就是选择目标序列,并设计gRNA了。

首先,你要了解你的细胞系和基因组序列,这关乎实验的多个因素。如果可能的话,你应当在设计gRNA之前,对计划修饰的区域进行测序,因为gRNA目标序列和真实序列之间的差异可能会影响切割效果。

之后,你就要确定对基因组中的哪个区域进行敲除或改造。这个具体位置将取决于你的特定应用。比如:

▪  在利用dCas9-激活子或dCas9-抑制子来激活或抑制目标基因时,gRNA应当针对目标基因的启动子区域。

▪  在敲除基因时,gRNA通常靶定5’端组成型表达的外显子,这样就降低了目标区域被剪接掉的可能性。同时,这个区域的移码突变也比较容易产生无功能的蛋白质。

▪  或者,可以让gRNA针对那些编码重要结构域的外显子。这样做的好处是,插入或缺失(通常由双链断裂产生)等非移码突变更可能改变蛋白质的功能。

▪  若使用同源指导修复(HDR),则目标序列必须靠近待编辑的位置。在这种情况下,你必须确定编辑发生的确切位置,并选择附近的目标序列。

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