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跟着文献做实验:轻松高效地纯化外泌体

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年7月14日 来源:生物通

摘要:

  在外泌体的研究中,当务之急是高效纯化外泌体。如今的方法这么多,不知如何选择?那么,我们就来读读最新的文献,听听其他研究人员的心得体会吧。近日,澳大利亚的研究人员发表文章,展现了来源于人肾近端小管上皮细胞(PTEC)的外泌体的分子图谱。

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外泌体(exosomes)这辆勤快的小货车在细胞间穿梭,运送着各种各样的分子货物,包括蛋白质、脂类、mRNA、miRNA和DNA。因此,它们在细胞间通讯中发挥着重要作用。

研究表明,外泌体由大多数细胞分泌,在体内执行着细胞免疫、组织修复、神经通讯和病原性蛋白转移等功能。它们广泛分布于外周血、尿液、唾液、腹水、羊水等多种体液中,其蛋白质、核酸和脂肪成分各异,因而有望成为新颖的生物标志物和潜在的治疗靶点。

外泌体的研究,大多遵循着这样的路线:采用超速离心、磁珠捕获、沉淀或过滤的方法,对外泌体进行前期的分离。之后利用电镜来分析其大小和形态,利用流式细胞仪来分析细胞表面标记,再通过Western blot和ELISA等方法对蛋白进行分析,或通过qPCR和新一代测序(NGS)来分析RNA。

首先,当务之急是高效纯化外泌体。如今的方法这么多,不知如何选择?那么,我们就来读读最新的文献,听听其他研究人员的心得体会吧。近日,澳大利亚的研究人员在《Journal of Extracellular Vesicles》期刊上发表文章,展现了来源于人肾近端小管上皮细胞(PTEC)的外泌体的分子图谱。

传统方法 vs. 试剂盒

在各种肾脏疾病中,人肾近端小管上皮细胞(PTEC)调控了疾病的进程。比如,在以炎症为特征的急性损伤期,PTEC可能发挥调节作用,而在以缺氧为特征的慢性纤维化疾病状态,PTEC可能发挥致病作用。一些研究也表明,来源于PTEC的外泌体可能在疾病发展中发挥作用。不过,目前还没有研究直接鉴定正常或疾病状态下人原代PTEC中的外泌体。

为了解决这个问题,研究人员在正常条件以及代表急性或慢性疾病的炎性和缺氧条件下培养了人原代PTEC,并鉴定和纯化了外泌体。他们的结果表明,利用一种商业化的试剂盒可轻松地从人原代PTEC中纯化外泌体,并且外泌体的数量在炎性和缺氧状态下升高。这些外泌体包含了与肾脏疾病相关的miRNA和蛋白质,有望作为治疗靶点。

在这项研究中,他们比较了两种外泌体纯化方法:传统的超速离心/密度梯度(UC/DG)和商业化的试剂盒,来自QIAGEN的exoEasy Maxi Kit。他们之所以花时间来开展这种比较,是因为对之前使用的UC/DG方法不甚满意。他们表示,UC/DG方法不仅费时费力,而且容易出现技术问题,包括离心管破裂和密度梯度解离,造成外泌体样本损失。

相比之下,采用exoEasy Maxi Kit,不仅简单高效,而且重复性更好。他们的研究结果清晰表明,通过此试剂盒纯化的外泌体在质量上与UC/DG方法相当,但产量要高得多,这也许是因为样本所经历的离心步骤大大减少。

从图中可以看出,利用超速离心/密度梯度纯化(UC-DG)和QIAGEN的exoEasy Maxi Kit获得的外泌体表现出相当的纯度。这两种方法纯化所得的PTEC外泌体都表达CD9,但不表达钙联蛋白(a)。从相同量的细胞培养物中纯化外泌体,试剂盒在产量上略胜一筹(b)。通过qNano纳米颗粒分析系统的分析,这两种方法产生的外泌体在大小分布上表现相当(c)。

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