王艳丽/章新政课题组合作在CRISPR-Cas系统切割RNA的研究中获得重大进展

王艳丽的研究组在2016年就开始利用结构生物学的方法研究Cas13a的结构和机理，并在2017年先后发表了两篇《Cell 》文章，阐明了不同来源的Cas13a结构。

　　

2017年7月27日，国际顶尖期刊Cell杂志在线发表了王艳丽组和章新政组在VI型CRISPR-Cas系统效应蛋白Cas13a（亦称C2c2）结构研究中取得的新进展。

该研究成功解析了Leptotrichia buccalis (Lbu)细菌中Cas13a与crRNA (CRISPR-RNA)及其target RNA三元复合物3.08Å的晶体结构、Cas13a与crRNA二元复合物3.2Å的电镜结构。研究结果证实target RNA的结合导致LbuCas13a的两个HEPN（发挥RNA干扰功能的结构域）结构域发生构象变化，从而激发LbuCas13a非特异性地切割任意单链RNA的酶切活性，该成果为研究Cas13a发挥RNA酶活性的分子机制提供了重要的结构生物学基础。

这是王艳丽课题组继今年1月于Cell首次报道Leptotrichia shahii（Lsh）细菌中Cas13a与crRNA 二元复合物以及Cas13a自由状态下的晶体结构后的又一重大突破。

几乎所有的古菌和约50%的细菌都具有CRISPR-Cas系统，用以抵抗病毒和质粒的侵染。CRISPR-Cas系统分为两大类，Cas13a是第二大类VI型系统中的效应蛋白，具有RNA介导的RNA酶切活性，是目前第二大类CRISPR-Cas系统发现的唯一能够降解RNA的蛋白（Cas9, Cpf1, C2c1均是RNA介导的DNA核酸内切酶），对开发研究RNA工具，扩展CRISPR系统在基因编辑方面的运用具有重大价值。 　

在一月份的文章中，王艳丽组通过解析沙氏纤毛菌Cas13a和crRNA复合物的结构，发现Cas13a蛋白可以分为两个单元，每一个都有RNA内切酶结构域。她们发现Cas13a中第一个单元中的Helical-1结构域含有RNA内切酶的活性位点，可以切pre-crRNA而得到成熟的crRNA，而第二个单元可以切靶点RNA。 　　

在这篇最新研究中，研究人员利用X-ray晶体学的方法又成功解析了LbuCas13a-crRNA-target RNA的三元复合物结构（3.08Å）。

通过冷冻电镜技术，获得了3.2Å LbuCas13a-crRNA的二元复合物结构。结构显示Cas13a具有REC和NUC两个叶片，其中NUC叶片包含两个HEPN结构域、Helical-2结构域以及连接两个HEPN结构域的连接结构域，两个HEPN结构域组成了Cas13a切割target RNA的活性区域。crRNA识别序列互补的目的 RNA，并与之结合形成双链RNA并被NUC叶片包围。同时，双链RNA的形成引起crRNA和Cas13a蛋白的构象变化，促使两个HEPN结构域相互靠近，进而激活Cas13a蛋白。研究人员通过结构和功能证明由crRNA和target RNA激活的Cas13a能切割任意单链的RNA。该研究发现为CRISPR-Cas13a系统的进一步开发提供了可靠的结构基础，对深入理解细菌抵御病毒入侵的分子机制提供了强有力的证据，并将对病毒引起的疾病的预防、检测、控制与治疗产生重大意义，特别是基于Cas13a高效的RNA酶切活性，对其应用于各类重大疾病的快速检测具有十分广阔的前景。 　

　

中国科学院生物物理所王艳丽研究员和章新政研究员为本文的共同通讯作者。王艳丽组的刘亮(博士后)、李雪岩（硕士研究生）、李宗强（工作人员）及章新政组的马军（副研究员）为本文的共同第一作者，该研究得到科技部、国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项（B类）以及“国家****项目”的资助，上海同步辐射光源（SSRF）、日本同步辐射光源SPring-8以及生物物理所生物成像中心为该研究提供了重要的技术支持。

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The Molecular Architecture for RNA-Guided RNA Cleavage by Cas13a （Cell 在线）

Two distant catalytic sites are responsible for C2c2 RNase activities Cell， 168(1)， 121-134.