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华人科学家开发改进版的多重置换扩增方法[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年8月4日 来源:生物通

摘要:

  多重置换扩增(MDA)是一种等温扩增方法,常常用于全基因组的扩增。MDA与新一代测序(NGS)的结合使用,已成为现在基因组研究的金标准方法。不过,MDA往往存在模板无关的扩增。为了解决这个问题,美国圣路易斯大学医学院的研究人员对MDA操作进行了改进。

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生物通报道  多重置换扩增(MDA)是一种等温扩增方法,常常用于全基因组的扩增。MDA与新一代测序(NGS)的结合使用,已成为现在基因组研究的金标准方法。不过,MDA往往存在模板无关的扩增。为了解决这个问题,美国圣路易斯大学医学院的研究人员对MDA操作进行了改进。他们的成果发表在《BioTechniques》上。

这篇文章的通讯作者之一是圣路易斯大学医学院的Xiaofeng Fan副教授。他早年毕业于南京医科大学,2000年进入圣路易斯大学健康科学中心工作。他主要研究丙型肝炎病毒的分子病毒学,以及发现新的病原体和疾病的生物标志物。

多重置换扩增广泛用于基因组或转录组的扩增。它通常使用phi29 DNA聚合酶,这种酶表现出出色的链置换和核酸外切酶活性。因此,MDA在模板覆盖度和扩增保真度上都优于PCR方法。此外,链置换扩增带来了高分子量(≥10kb)的产物,这特别适合NGS的文库构建。基于这些原因,MDA与NGS常常配合使用。

然而,MDA也长期存在一个问题,那就是模板无关的扩增(template-independent amplification,TIA),特别是在扩增超低浓度的模板时。阴性对照中TIA引起的阳性扩增不仅破坏了实验结果的可信度,更重要的是,产生了垃圾DNA。在某些研究中,即使MDA经过全面优化,垃圾DNA可能也占了70%。

于是,人们采用种种手段来消除垃圾DNA,但这些方法均没有广泛采用。许多商业化试剂盒建议,增加模板量(≥10ng)并缩短孵育时间,以便最大程度避免TIA,不过,许多研究往往达不到这样的样本量。

为此,圣路易斯大学的研究团队使用5’端封闭的随机五聚体引物,开发出一种可靠的MDA操作方案。这种等温扩增仅仅以模板依赖的方式进行,因此被命名为tdMDA(template-dependent)。他们利用这种方案对人类循环RNA进行了有效扩增,从而证明了tdMDA的潜力。

研究人员采集了30份血清样本,从0.2 mL样本中提取出RNA,接着利用多种方法来去除残留的基因组DNA。然后,他们利用5’端封闭的随机五聚体引物来开展逆转录和MDA,以便消除模板无关的扩增。利用扩增产物构建测序文库之后,他们在Illumina的NextSeq 500测序平台上开展测序。

研究结果表明,与常规MDA相比,tdMDA处理后阴性对照中可定量的DNA扩增明显减少,这反映为Illumina测序中无法比对的序列减少(7 ± 10.9% vs. 58.6 ± 39%),而血清转录组的比对率增加(26.9 ± 7.9% vs. 5.8 ± 8.2%)。转录组图谱可以将慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染的患者与HCV相关的肝细胞癌(HCC)患者区分开来。

作者总结道,他们开发出一种简单而可靠的解决方案,可消除MDA中的模板无关扩增。利用tdMDA,他们证明0.2 mL患者血清也能实现循环RNA的有效分析。肝炎和肝癌患者的转录组图谱差异进一步证明了tdMDA有望应用于液体活检。(生物通 薄荷)

深入了解号称基因组复印机的REPLI-g多重置换扩增产品

原文检索

Template-dependent multiple displacement amplification for profiling human circulating RNA

BioTechniques, Vol. 63, No. 1, July 2017, pp. 21–27

(http://www.ebiotrade.com/)
版权所有,未经书面许可,不得转载

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