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降低脱靶效应,通过电穿孔导入CRISPR编辑元件

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年8月8日 来源:生物通

摘要:

  与借助质粒导入Cas9基因序列方法相比较,电穿孔导入方法避免了残留Cas9基因的持续表达,有效抑制了脱靶效应。它无需经过蛋白质转录•翻译•表达的过程,可以实现快速有效的突变导入。Takara旗下公司Clontech的Guide-it Recombinant Cas9(Electroporation-Ready)就是专为此用途而设计的。

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在CRISPR/Cas9基因编辑中,人们可通过各种不同的方法来导入编辑工具。质粒转染是一种普遍使用的方法,但未必适用于那些难于对付的细胞,比如人诱导多能干细胞(iPSC)。若您的实验室中有电穿孔仪,那么不妨试试电穿孔的方法,将Cas9核酸酶导入细胞。

与借助质粒导入Cas9基因序列方法相比较,电穿孔导入方法避免了残留Cas9基因的持续表达,有效抑制了脱靶效应。它无需经过蛋白质转录•翻译•表达的过程,可以实现快速有效的突变导入。Takara旗下公司Clontech的Guide-it Recombinant Cas9(Electroporation-Ready)就是专为此用途而设计的。

Guide-it Recombinant Cas9(Electroporation-Ready)是来源于野生型化脓性链球菌Streptococcus pyogenes,适用于CRISPR/Cas9基因编辑实验的重组Cas9蛋白质溶液。高浓度Cas9蛋白质溶液中的甘油浓度比其他公司低,特别适用于电穿孔导入方法。

不过,需要注意的是,Cas9导入细胞前首先需要形成Cas9-sgRNA核糖核蛋白复合物,sgRNA制备推荐使用Guide-it sgRNA In VitroTranscription Kit或者Guide-it Complete sgRNA Screening System。效果如何?请看下图。

图1. AAVS1或者CXCR4基因同源重组修复(HDR)效率

Guide-it Recombinant Cas9(Electroporation-Ready)和修复模板复合物通过电穿孔的方式导入至CD34+造血干细胞中检测同源重组修复(HDR)效率。将包含Hind III酶切位点的修复模板插入至AAVS1 基因中,包含Hind III和BamH I酶切位点的修复模板插入至CXCR4基因中。之后通过对细胞内靶基因进行PCR扩增和限制酶剪切分析,确认突变导入效率。基因编辑效率标注在凝胶阳性孔处。在基因编辑前野生型CXCR4基因已包含1处BamH I位点,因此BamH I剪切CXCR4基因后额外多显示一条条带。

图2. 不同公司Cas9产品在hiPS細胞中基因敲除效率比较

剪切后电泳条带的强弱可以半定量估计发生基因编辑细胞的百分数。Guide-it Recombinant Cas9(Electroporation-Ready)与Guide-it sgRNA In Vitro Transcription Kit制备的sgRNA相结合,通过电穿孔的方法导入Cellartis hiPSC-18细胞,采用Guide-it Mutation Detection Kit确认突变导入效率,%即表示基因编辑效率。如图所示,Guide-it Recombinant Cas9(Electroporation-Ready)在多数靶基因位点均显示有效的基因编辑。

比较结果来自于Takara Bio USA, Inc.

(http://www.ebiotrade.com/)
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