长读长测序揭秘基因组中被遗忘的角落

近年来，科学家逐渐意识到人类基因组中结构变异的临床意义。这些较大的变异通常大于50 bp，可能导致许多遗传病，包括脆性X综合征、杜氏肌营养不良症、肌萎缩侧索硬化症（ALS）以及Tay-Sachs病等。然而，由于大小的关系，结构变异并不能像单核苷酸变异那样，通过短读长的测序方法来研究。

它们有些是插入变异，长度超过许多测序技术的读长；有些是重复区域，为序列比对增加难度；有些则是富含GC的区域，为本身有覆盖偏好的技术带来挑战。因此，这些重要的基因组元件往往被过去的人类基因组测序工作所错过，成为被遗忘的角落。

单分子实时测序（SMRT）技术的出现以及超过12 kb的平均读长，让科学家如今能够可靠地检测结构变异。最新发表的研究表明，以前的人类基因组数据明显低估了结构变异的数量，以及它们对健康和疾病的影响。下面我们就来回顾一下。

对付疑难杂症

近期发表的多项研究表明，深入了解结构变异对临床研究人员来说益处多多，可帮助他们研究罕见病和无法诊断的疾病。举个例子，斯坦福大学的Euan Ashley及合作者最近在《GENETICS in MEDICINE》上发表文章，表明长读长测序可以检测一种由结构变异引起的罕见病。

这项研究中的患者从7岁开始患病。他进出医院20年，先后切除了心脏粘液瘤、睾丸肿块、垂体瘤，但始终无法得到明确的诊断。虽然症状与Carney综合征这种罕见疾病的症状一致，但基因检测和短读长的全基因组测序未能检测到致病突变。

于是，Ashley及其团队开始转向PacBio的长读长测序技术。研究终于有了突破性进展，他们发现PRKAR1A中有一段2.2 kb的缺失，这个基因与Carney综合征有关。此时的测序覆盖度是8倍，表明即使是低倍数的长读长覆盖也能带来结构变异的信息，从而提供重要的临床见解。（延伸阅读：PacBio首次确认一种疾病大片段缺失突变）

在另一个例子中，加州大学戴维斯分校的研究人员则利用长读长测序来研究与脆性X综合征相关的重复扩增。这种遗传疾病伴随着X染色体上一段三核苷酸序列（CGG）的扩增。利用SMRT测序技术，这个区域首次被完整测序。要知道，某些病例的CGG重复长达几kb，让之前的测序方法无力招架。

研究人员认为，重复区域的准确计数不仅实现了脆性X综合征的诊断，对于其他重复扩增疾病而言也是至关重要的，比如ALS（俗称渐冻人症）和亨廷顿病。（延伸阅读：单分子测序助力脆性X综合征的研究）

助力群体研究

结构变异的全面分析对遗传病研究也很重要。对于那些至今原因不明的遗传病，寻找致病基因时就需要能检测各种遗传变异的方法，从单核苷酸变异到更大的结构变异。

华盛顿大学和麦克唐纳基因组研究所的研究人员在这方面取得了重大进展。他们利用SMRT测序技术来寻找两个单倍体人类细胞系中的结构变异，并分类汇总。他们找到了插入、缺失及其他类型的变异，短的只有2 bp，长的高达28 kb。

对这46万个结构变异和插入缺失进行分析，研究人员发现超过89%的变异被“千人基因组计划”所遗漏。他们又开展了广泛的后续研究，以验证检测到的结构变异，并得出结论，大多数变异实际上是人类共有的。

“单个人类二倍体基因组中理论上的遗传变异数量远远超过之前全基因组研究建立的预期，”研究人员在《Genome Research》的论文中报告称。“尽管这仅仅代表两个单倍体之间一部分的变异位点，但对于两个基因组而言，这些变异起了重要的作用。”早前的一些研究成果也表明，造成人与人之间差异的，更多是这种结构变异，而不是单碱基差异。

这一类的结构变异信息将对大规模的群体研究特别有用，比如目前许多国家正在开展的基因组计划。添加这种新型的变异将提高整体的遗传发现能力，并改善表型与基因型之间的关联。

展望未来

PacBio人类生物医学应用的高级总监Luke Hickey表示，为了更好地理解和解释结构变异，人们应当建立一个完整、公开的变异数据库。一旦建立，这种数据库将对罕见病研究和遗传关联研究十分有价值。

目前，一些私营机构正努力构建类似的数据库，比如诺禾致源。这家公司在今年总共采购了20台PacBio Sequel测序系统。据创始人兼CEO 李瑞强博士介绍，公司正计划对1000个中国人进行测序，并构建结构变异数据库。此项目将作为中国精准医疗项目启动的一部分。

“既然我们有了一种可靠而实惠的方法来检测结构变异，那么现在的临床和疾病研究也是时候囊括全部类型的人类遗传变异了。只有这样，我们才能充分发挥遗传探索的力量，并实现精准医疗的全面承诺，”Hickey谈道。（生物通 余亮）

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