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怎么办?我的ChIP为何屡屡失败?

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2017年9月22日 来源:基因有限公司

摘要:

  ChIP实验是最有效的验证蛋白与DNA相互作用的实验方法,也是许多科研工作者追求高水平文章过程中必须跨越的坎,今天为大家总结一些独家!独家!独家! ChIP秘籍,帮助各位挣扎在ChIP上的实验汪们早日脱离苦海。

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染色质免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipition, ChIP)实验是最有效的验证蛋白与DNA相互作用的实验方法,也是许多科研工作者追求高水平文章过程中必须跨越的坎,今天为大家总结一些独家!独家!独家! ChIP秘籍,帮助各位挣扎在ChIP上的实验汪们早日脱离苦海。

我们先来看一下ChIP的实验流程:

ChIP实验是一个研究蛋白质和DNA相互作用的实验,因此,在这个实验中,有三件事情,是最重要的:

• 要维持蛋白质和DNA手拉手的状态(固定交联要恰当)
• 抗体要能够成功识别蛋白质(抗原表位要保护好)
• DNA的检测——下游PCR和测序要能成功(染色质片段化要均一彻底)

ChIP实验的条件是一定要进行优化的,哪些部分需要着重优化和注意呢?

1. 固定试剂以及固定时间

ChIP实验的固定比其他实验的固定要求都要严格。不同的甲醛原料甚至都对固定效果有影响。请不要使用粉末状的多聚甲醛作为原料配制固定液,因为粉末的多聚甲醛会形成不同的多聚体,每种多聚体的固定效率不同,很容易造成重复性的降低。也请不要选择含有甲醇的37%甲醛,甲醇是用以抑制甲醛聚合的,但时间一长甲醇挥发后甲醛就又恢复聚合状态,导致不稳定。推荐大家使用16%甲醛溶液,仅含有甲醛单体,无复合物,可以提供最好的、最准确的固定结果。最推荐的是安瓿包装,即开即用。

请一定对固定时间进行优化!绝大部分实验汪们固定的时间太久了。当然固定时间也不要过短。不同的细胞种类、细胞数量都请使用不同的固定时间。固定时间过长不仅会使蛋白质-DNA聚合物过于紧密,导致片段化困难、解交联困难,还会损伤抗原表位,导致抗体难以成功结合。关于甲醛浓度,可从1%甲醛浓度开始摸索,细胞数量少的话请适当降低甲醛浓度。


 
*圆圈所指部位是固定过度(20min)后产生的片段化困难的大分子聚合物

*随着固定时间的增长,蛋白对IgG的非特异性结合显著升高

2. Shearing buffer中的SDS浓度

高浓度的SDS对抗原表位的损伤很显著。请选择低SDS浓度的Shearing buffer(0.1%或更低)。抗原表位负责与抗体结合,对免疫共沉淀的成功至关重要,需要认真保护!在IP过程中,SDS的浓度低一些结果会更好。

*随着shearing buffer中SDS浓度的升高,ChIP的富集倍数显著降低。

3. 染色质片段化

不是片段化越彻底,结果就会越好。分布紧密的DNA碎片看起来赏心悦目,上面结合的蛋白却很有可能已经遭受表位受损。使用温控不好的片段化仪器,生物大分子分分钟降解;即使是优秀的温控仪器,长时间的剪切力也会对抗原表位造成损伤。请在抗原表位和染色质片段化效果中找到一个平衡,以达到最佳的实验效果。特别推荐在片段化后使用ChIP抗体对抗原表位进行验证,在条件摸索阶段尽可能监控更多的步骤,提高实验成功率。

*虽然进行12分钟片段化可以达到更充分的片段化效果,但是western结果显示抗原表位已经开始受损。

请选用更好的片段化仪器进行片段化。抛弃探头超声吧,噪音大不说,微量样本hold不住,还容易造成交叉污染。大功率的水浴超声也可以考虑放弃了,除去作用在样本的超声能,剩下的能全部转化为热能,变成大锅煮样本,还怎么好好保护抗原表位?许多同学总是纳闷,大功率的水浴超声片段化效果不错呀,可是ChIP总是做不出来,到底为什么?做做western验证看看您的抗原表位吧。

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