Cas13和REPAIR系统如何实现精确的RNA编辑[创新技巧]

在CRISPR的舞台上，Cas9不再是唯一的主角，Cas13核酸酶也正在吸引更多目光。去年，Broad研究院的张锋实验室就利用Cas13实现了精确的RNA编辑，此成果发表在《Science》杂志上。

这个称为REPAIR（RNA editing for programmable A to I (G) replacement）的新系统是第一个精确编辑RNA的CRISPR工具，表现出高度的特异性和灵活性。下面我们就来看看这个工具是如何开发的，以及它有哪些应用。

Cas13的背景

之前的研究表明，Cas13a稳定切割细菌和动植物细胞中的RNA。Abudayyeh等人比较了来自纤毛菌的Cas13a以及shRNA的knockdown效果，发现Cas13a表现出更高的特异性。他们还证实，催化失活的dCas13a可作为一种可编程的RNA结合蛋白。

张锋实验室的Cox等人则致力于利用Cas13构建一种RNA编辑的酶。与传统的DNA编辑系统相比，RNA编辑有不少好处。首先，RNA编辑不需要同源指导修复（HDR）机制，因此适用于不分裂的细胞。Cas13酶不需要靶位点上的PAM序列，比Cas9更灵活。同时，它不包含切割DNA的RuvC和HNH结构域，所以不能直接编辑基因组，在安全性上更好。此外，基于Cas13的RNA编辑系统也许是可逆的。

1.0版本

于是，研究人员设想出一款双组分的RNA编辑器：Cas13与RNA腺苷脱氨酶（ADAR）融合。此系统能够将腺苷转化成肌苷，它在结构上与鸟苷非常接近。这种RNA编辑器能够造成RNA的点突变，从而拯救已知的致病突变（G→A），或提前引入终止密码子，造成RNA没有功能。

为了构建出一款可靠的RNA编辑器，研究人员做了大量的尝试。他们检验了21种Cas13a同源物、15种Cas13b同源物和7种Cas13c同源物。他们想找到稳定折叠的同源物。最终，他们选择了来自普氏菌属的Cas13b。这种酶（PspCas13b）的平均knockdown效率达到62.9%。它不需要PFS序列，对目标RNA的错配敏感。

对于编辑的部分，Cox等人检验了ADAR1和ADAR2。他们将ADAR的脱氨酶结构域（ADARDD）与Cas13b相融合，但观察到较低的RNA编辑。为了增加A→G的编辑，他们采用了极度活跃的ADAR构建体，如ADAR2DD (E488Q)。他们还调整向导RNA的结构，在待编辑的A对面引入C。当gRNA的间隔区存在多个A时，这种改变能够指定编辑的位置。

他们发现，当间隔区长度在30-84个核苷酸时，PspCas13b-ADAR2DD (E488Q)表现出稳定编辑，并将此系统命名为REPAIRv1。利用新一代测序，他们证实了A→I的编辑，并发现50 nt间隔区提高了编辑效率，但也增加了脱靶编辑，这可能是由于双链RNA较长。利用ADAR2DD催化突变体，他们发现编辑的确是由ADAR2DD介导的。

2.0版本

为了检验REPAIRv1的稳定性，Cox等人研究了ClinVar数据库中34个致病的G→A突变。他们成功编辑了34个位点中的33个，HEK293T细胞中的最高编辑效率达28%。由于REPAIRv1太大，无法装到腺相关病毒中，他们又检验了截短的ADARDD，看看这次行不行。最后，他们成功将REPAIRv1的大小从4,473 bp缩小到4,152 bp，而不影响编辑效率。

尽管REPAIRv1的knockdown比shRNA更精确，但仍然表现出大量的脱靶效应。Cox等人推测脱靶是由于ADAR2DD，而不是Cas13b，于是便开始改造ADAR2DD。通过突变实验，他们发现2.0版本的ADAR2DD(E488Q/T375G)有着最高的靶向效率和最低的脱靶效应。在一项转录组范围的比较研究中，脱靶位点从REPAIRv1的18,385个减少到REPAIRv2的20个。

未来的方向

REPAIR是第一个能够实现精确RNA编辑的CRISPR系统。Cox等人指明了未来的方向，包括将dCas13b与胞苷脱氨酶（如APOBEC1）相融合，或者改造ADAR以接受胞嘧啶底物。如果您对REPAIR系统感兴趣，可以联系Addgene获取质粒。（生物通 薄荷）

原文检索

RNA editing with CRISPR-Cas13

Science  25 Oct 2017: eaaq0180
DOI: 10.1126/science.aaq0180