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Cas13和REPAIR系统如何实现精确的RNA编辑[创新技巧]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年1月12日 来源:生物通

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  这个称为REPAIR(RNA editing for programmable A to I (G) replacement)的新系统是第一个精确编辑RNA的CRISPR工具,表现出高度的特异性和灵活性。下面我们就来看看这个工具是如何开发的,以及它有哪些应用。

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在CRISPR的舞台上,Cas9不再是唯一的主角,Cas13核酸酶也正在吸引更多目光。去年,Broad研究院的张锋实验室就利用Cas13实现了精确的RNA编辑,此成果发表在《Science》杂志上。

这个称为REPAIR(RNA editing for programmable A to I (G) replacement)的新系统是第一个精确编辑RNA的CRISPR工具,表现出高度的特异性和灵活性。下面我们就来看看这个工具是如何开发的,以及它有哪些应用。

Cas13的背景

之前的研究表明,Cas13a稳定切割细菌和动植物细胞中的RNA。Abudayyeh等人比较了来自纤毛菌的Cas13a以及shRNA的knockdown效果,发现Cas13a表现出更高的特异性。他们还证实,催化失活的dCas13a可作为一种可编程的RNA结合蛋白。

张锋实验室的Cox等人则致力于利用Cas13构建一种RNA编辑的酶。与传统的DNA编辑系统相比,RNA编辑有不少好处。首先,RNA编辑不需要同源指导修复(HDR)机制,因此适用于不分裂的细胞。Cas13酶不需要靶位点上的PAM序列,比Cas9更灵活。同时,它不包含切割DNA的RuvC和HNH结构域,所以不能直接编辑基因组,在安全性上更好。此外,基于Cas13的RNA编辑系统也许是可逆的。

1.0版本

于是,研究人员设想出一款双组分的RNA编辑器:Cas13与RNA腺苷脱氨酶(ADAR)融合。此系统能够将腺苷转化成肌苷,它在结构上与鸟苷非常接近。这种RNA编辑器能够造成RNA的点突变,从而拯救已知的致病突变(G→A),或提前引入终止密码子,造成RNA没有功能。

为了构建出一款可靠的RNA编辑器,研究人员做了大量的尝试。他们检验了21种Cas13a同源物、15种Cas13b同源物和7种Cas13c同源物。他们想找到稳定折叠的同源物。最终,他们选择了来自普氏菌属的Cas13b。这种酶(PspCas13b)的平均knockdown效率达到62.9%。它不需要PFS序列,对目标RNA的错配敏感。

对于编辑的部分,Cox等人检验了ADAR1和ADAR2。他们将ADAR的脱氨酶结构域(ADARDD)与Cas13b相融合,但观察到较低的RNA编辑。为了增加A→G的编辑,他们采用了极度活跃的ADAR构建体,如ADAR2DD (E488Q)。他们还调整向导RNA的结构,在待编辑的A对面引入C。当gRNA的间隔区存在多个A时,这种改变能够指定编辑的位置。

他们发现,当间隔区长度在30-84个核苷酸时,PspCas13b-ADAR2DD (E488Q)表现出稳定编辑,并将此系统命名为REPAIRv1。利用新一代测序,他们证实了A→I的编辑,并发现50 nt间隔区提高了编辑效率,但也增加了脱靶编辑,这可能是由于双链RNA较长。利用ADAR2DD催化突变体,他们发现编辑的确是由ADAR2DD介导的。

2.0版本

为了检验REPAIRv1的稳定性,Cox等人研究了ClinVar数据库中34个致病的G→A突变。他们成功编辑了34个位点中的33个,HEK293T细胞中的最高编辑效率达28%。由于REPAIRv1太大,无法装到腺相关病毒中,他们又检验了截短的ADARDD,看看这次行不行。最后,他们成功将REPAIRv1的大小从4,473 bp缩小到4,152 bp,而不影响编辑效率。

尽管REPAIRv1的knockdown比shRNA更精确,但仍然表现出大量的脱靶效应。Cox等人推测脱靶是由于ADAR2DD,而不是Cas13b,于是便开始改造ADAR2DD。通过突变实验,他们发现2.0版本的ADAR2DD(E488Q/T375G)有着最高的靶向效率和最低的脱靶效应。在一项转录组范围的比较研究中,脱靶位点从REPAIRv1的18,385个减少到REPAIRv2的20个。

未来的方向

REPAIR是第一个能够实现精确RNA编辑的CRISPR系统。Cox等人指明了未来的方向,包括将dCas13b与胞苷脱氨酶(如APOBEC1)相融合,或者改造ADAR以接受胞嘧啶底物。如果您对REPAIR系统感兴趣,可以联系Addgene获取质粒。(生物通 薄荷)

原文检索

RNA editing with CRISPR-Cas13

Science  25 Oct 2017: eaaq0180
DOI: 10.1126/science.aaq0180

(http://www.ebiotrade.com/)
版权所有,未经书面许可,不得转载

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