第一次利用CRISPR基因组激活技术生成干细胞
丁胜Cell Stem Cell再获重要突破

【字体: 时间:2018年01月22日 来源:生物通

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  激活单个基因就可以将皮肤细胞转变为干细胞!

  

CRISPR+iPS=?

干细胞能够分化成为机体内任何类型的细胞,既是研究人体早期发育的理想工具,也是细胞治疗的宝贵资源。胚胎干细胞很适合临床使用,但获得这些细胞会破坏胚胎,有很大的伦理争议。2006年日本科学家山中伸弥开发了一个变通方案,用逆转录病毒将四个转录因子(OSKM)引入特化的成体细胞,再将其重编程为诱导多能干细胞(iPSC)。这些细胞在实验室中表现出与胚胎干细胞相当的能力,又避开了胚胎干细胞的伦理问题,在疾病模拟、药物筛选和细胞治疗中有着巨大的应用前景,被人们视为细胞疗法的新希望。山中伸弥也因为iPS技术赢得了2012年的诺贝尔生理/医学奖。

而CRISPR是指规律成簇的间隔短回文重复,细菌通过CRISPR与内切酶Cas组成的防御系统对抗外来侵略者。CRISPR-Cas能根据导R向NA的指引切割入侵者的遗传物质。2012年研究者们利用这一特点,将CRISPR系统发展成了强大的基因组编辑工具。该系统可以简单精确地编辑任何基因组区域,据说新手可在一周内学会用CRISPR编辑传统的永生细胞系(比如HeLa或HEK293)。此外,研究者们还在CRISPR的基础上开发了调控基因表达的新工具。

这两种热门技术的结合已经带来了一加一大于二的效果:CRISPR用于人类iPSC可以揭示基因在特定疾病中起到的作用,甚至可以校正患者细胞的基因缺陷。

全新诱导多能干细胞技术

来自Gladstone研究所,清华大学药学院的研究人员利用CRISPR技术激活了一个特殊基因,完成了小鼠皮肤细胞向干细胞的转变过程,这种创新的方法提出了一种更简单的生成有价值细胞类型的技术,并有助于了解细胞重编程过程的分子机制。

这一研究成果公布在1月Cell Stemm Cell杂志上,由丁胜博士领导完成,这位早年毕业于北京大学的干细胞专家在合成化学、干细胞生物学以及药物研发技术方面具有很强的科研实力和独特见解,创造性地开拓了“干细胞化学生物学”这一前沿性新领域。2015年他就任清华大学药学院首任院长。领军iPS技术 “闯入”干细胞领域的丁胜博士

对于这项最新成果,他表示:“这是一种全新的诱导多能干细胞方法,与之前的方法截然不同。在研究开始的时候,我们并不抱希望,但想至少可以解答这个问题:能否通过解锁基因组的某个特定位置来重新编程一个细胞?答案是肯定的。”

多能干细胞可以转化为体内的任何细胞类型。因此是针对目前尚无法治愈的疾病,如心力衰竭,帕金森病和失明症的关键治疗资源。同时多能干细胞还为研究疾病提供了很好的模型,也可以在人体细胞中作为检测新药物的工具。因此也成为了生命科学领域的一大热点。

不同于之前需要转录因子的诱导多能干细胞,丁胜研究组的这种新方法采用的是化学试剂鸡尾酒配方,这样可以通过CRISPR基因调控技术直接操纵细胞的基因组,将皮肤细胞转化为干细胞。

“在诱导生成多能干细胞的时候,可以有多种选择,这对于在一种方法上遇阻的科学家来说十分有用。我们的方法是生成iPSCs的更简单方法,可以被用来将皮肤细胞直接重编程为其它细胞类型,如心脏细胞或脑细胞”,丁胜博士说。

CRISPR是一个强大的工具,可以靶向DNA某段特殊序列来精确操纵基因组,之后DNA序列被永久删除或替换,也可以暂时打开或关闭。

这一研究组主要靶向两个基因:Sox2和Oct4,这两个基因只在干细胞中表达,科学家认为它们与多能性密切相关。这些基因和转录因子一样,能开启其他干细胞基因,并关闭不同细胞类型相关的基因。

研究人员发现利用CRISPR可以激活Sox2,或者Oct4,实现细胞重编程。 他们指出,在基因组上一个单位点就足以开启天然的连锁反应,导致细胞重编程为iPSC。而传统方法通过利用的是四种转录因子,更重要的是,一个转录因子通过能靶向细胞中数千个基因组位置,改变每个位置上的基因表达。

“调整一个位点就足够了,这一点非常令人惊讶。接下来我们将会继续了解这整个过程,即如何从一个单位点扩散到整个基因组的。”

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技术指南

基本工作流程

在人iPSC中用CRISPR编辑基因或者控制基因表达,你需要开启两条平行的任务线:1)培养充足且可靠的多能干细胞;2)针对目的基因设计20nt的导向RNA。

研究者们目前主要通过电穿孔递送向导RNA和Cas9核酸酶,因为这种方法能在保证细胞存活的同时送入更多DNA和蛋白。你可以在市面上找到自动化的台式系统,比如Lonza的Nucleofector系统和ThermoFisher的Neon系统。Gladstone心血管病研究所的博士后Mohammad Mandegar奉劝大家,如果不是高通量细胞筛选,请不惜一切代价避免慢病毒递送,因为人多能干细胞似乎会天然沉默慢病毒送入的基因。

抗生素抗性可以帮助我们挑选经过编辑的克隆。研究者们一般将抗生素抗性、荧光报告基因和流式细胞仪结合起来,富集那些转染成功的细胞,把它们铺在单孔或多孔板上。通过追踪细胞形态、多能性标志物和细胞分化能力可以评估细胞的多能性。专家建议每10-20代或者每次细胞操作之后进行核型分析,确保细胞的染色体数量正常。

iPS细胞系如今有许多购买渠道,各大实验平台和公司都提供有相应的服务。此外,iPS重编程方案也非常多。加州大学伯克利分校的细胞生物学家Dirk Hockemeyer表示,我们应当找到最适合自己的方案,在开始CRISPR编辑之前一定要很好地掌握这些细胞。

人多能干细胞VS人肿瘤细胞系

专家们还建议,在着手iPSC之前先用人类癌细胞系试一试CRISPR-Cas9工具。在对iPSC动手的时候牢记一点:操作人iPSC更繁琐、更讲究也更加昂贵。

据介绍,有经验的研究者用大约一个月的时间能学会基础的人iPSC培养。由于新方案和试剂经常出现,操作这些细胞是一个不断学习的过程,哈佛医学院George Church实验室的博士后Susan Byrne说。“我告诉本科生,如果在正确的指导下操作这些细胞,你们将在六个月内成为专家。但人们一开始总是低估了这种技术,”哈佛干细胞研究所的Chad Cowan补充道。

请记住,每一个干细胞系都是独特的。这会影响细胞培养和向导RNA的效果 。“供体和重编程方法都会带来变异,”Byrne说。“有时我们需要对特定干细胞系进行方案优化。”一般来说,就算细胞系很健康、实验方案很完美,人iPSC和ESC的编辑效率也会比癌细胞系低十倍,Johns Hopkins大学医学院的Linzhao Cheng指出。

深入了解你的基因

知己知彼,百战不殆。了解你想要编辑的基因座,认识那些可能转录的序列,可以帮助你设计出最佳编辑方案。举例来说,有些基因在编辑之后仍能表现出一定的生物学活性。在这种情况下,你可能需要切割更大的区域。

选择多个向导RNA并对它们进行测试。现在已经有很多软件可以筛选向导RNA。不过,就算是特异性非常好的向导RNA也有可能效果不佳,甚至根本不起作用。造成这种情况的原因很多,比如你可能没有足够好的参考基因组。此外,你可能需要优化向导RNA的活性,加州大学圣地亚哥分校的生物工程师Prashant Mali说。他和George Church领导团队在Nature Methods杂志上发表文章,向人们展示了获得活跃向导RNA的通用设计规则。

敲除VS精确编辑

当你用CRISPR-Cas9切割基因的时候,主要有两个分子通路在执行DNA修复。这两个同时发生的通路决定了基因编辑的精确性。非同源末端连接(NHEJ)负责敲除基因,制造破坏基因功能的小插入/缺失。同源介导修复(HDR)根据供体DNA精确改变核苷酸序列。

不少研究者在进行基因组编辑的时候使用偏向HDR的条件。他们发现,人多能干细胞的编辑效果比传统永生细胞系差,转染100个iPSC只能引入一个正确的改变。这是CRISPR基因组编辑面临的一个主要挑战,不过Hockemeyer觉得自己的团队还能应付。“如果你有很好地组织培养流程,那么挑200个克隆就能获得2个正确克隆。一个学生在三小时内就能搞定,”他介绍道。

Hockemeyer及其同事正在开发新策略,试图让天平向HDR倾斜,比如采用特殊化合物或者其他物种的Cas9。“我认为这个问题很可能未来几年内就能得到解决,”Hockemeyer表示。

Conklin团队开发了一种快速数字PCR测试,用来定量HDR和NHEJ的修复效率。他们的研究显示,在人iPSC和其他一些细胞中,HDR和NHEJ效率之间并没有什么关系。

“万例CRISPR-AI敲除小鼠精子库,最快7周获得阳性小鼠”索取详细资料

验证你的基因组编辑

如何证明CRISPR系统完成了正确的切割呢?你可以给细胞提供与编辑基因互补的DNA,这些DNA应该能够挽救相应的细胞表型。如果细胞表型变化很小难以观察,你可以尝试再次编辑这个基因,看看能否使其恢复成野生型,Hocke­meyer说。

研究者们也会抽查自己的基因组,比如对编辑区域进行PCR和Sanger测序。免费算法TIDE(tide.nki.nl/; for Tracking of Indels by DEcomposition)可以在PCR和Sanger测序数据的基础上鉴定目标突变及其发生的频率。

外显子组测序将成为验证基因组编辑的首选方法。“测序可能是对你整个系统最完全的分析。如果这个细胞系要用上十年,那么测序就是你应该做的投资。你需要确保一切都尽善尽美,”Mali指出。同时我们也应当请牢记,遗传学差异会随着时间的推移慢慢累积,任何细胞系都不例外。

脱靶效应并非大问题

针对同一个位点设计两个以上有充分差异的向导RNA,这是防止脱靶编辑一个主要途径。总的来说,脱靶效应对于绝大多数基础研究者来说并不是什么特别大的问题,Cowan认为。CRISPR系统在人多能干细胞中的脱靶效应比癌细胞系少得多,Cheng也表示。但如果真的很担心脱靶,全外显子测序将是你最好的选择。

用CRISPR调控基因表达

如果你指望在多能干细胞中敲除多能性必需基因,那你肯定要失望了。因为敲除这些基因会导致细胞死亡。在这种情况下,我们只能选择下调(或上调)基因的表达水平。研究者们为此打造了失去催化活性的dCas9,dCas9能到达向导RNA指定的位点,但无力对DNA进行剪切。用dCas9抑制转录的策略被称为CRISPRi,用dCas9激活转录的策略被称为CRISPRa。

基因表达控制和基因编辑之前的主要区别在于,基因表达控制并非永久性改变基因组。你可以干扰细胞沉默基因,然后再逆转这种抑制。此外,与CRISPR-Cas9相比,CRISPRi和CRISPRa的脱靶效应更小。

CRISPR调控基因表达也存在一定的挑战。举例来说,设计一组可靠的向导RNA很难,Mali说。在理想情况下,向导RNA应当避开紧紧缠绕核小体的基因组区域。但有时候我们想要靶标的位点就在这些区域里。

将CRISPRa和CRISPRi送入人多能干细胞也比较复杂。“使CRISPRa和CRISPRi进入70-80%的细胞依然很难,除非你使用病毒来递送。通常我们说的都是30-40%的细胞,”Cowen指出,他正在用CRISPRa激活和验证报告基因。这种方法对他很有帮助,因为iPSC很难分化成他想要的肾内皮细胞。

原文标题:

CRISPR-Based Chromatin Remodeling of the Endogenous Oct4 or Sox2 Locus Enables Reprogramming to Pluripotency

 

 

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