Nature Methods:直接测序RNA的新方法

【字体: 时间:2018年01月25日 来源:生物通

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  《Nature Methods》上最新发表的一项研究表明,纳米孔测序技术可实现RNA直接测序,产生实时的序列数据,无需逆转录或扩增,从而避免引入偏倚。这是目前第一种真正直接的RNA-seq方法。

  

生物通报道  《Nature Methods》上最新发表的一项研究表明,纳米孔测序技术可实现RNA直接测序,产生实时的序列数据,无需逆转录或扩增,从而避免引入偏倚。这是目前第一种真正直接的RNA-seq方法。

细胞的转录组蕴含了丰富的信息,包括基因的结构、转录本的表达水平和反义转录。捕获这些信息的最好方法是准确、定量地揭示碱基的存在和身份,而不需要预先知道序列。当然,这种方法最好能生成跨越剪接点的连续序列。

目前最常用的RNA-seq策略是利用poly(dT)引物或随机六聚体引物进行cDNA合成。之后再通过PCR来扩增这些cDNA链,不过这可能会降低cDNA文库的复杂性,影响cDNA的相对丰度,并造成某些种类的RNA丢失。此外,在PCR扩增过程中,RNA的所有修饰都会丢失。

现在有两种方法在制备RNA-seq文库时不需要PCR扩增。它们分别是Illumina平台上的FRT-seq技术和Helicos平台上的DRS技术。不过,这两种方法都产生短序列,这使得人们难以正确鉴定真核生物中的选择性剪接。

为此,Oxford Nanopore公司的研发人员利用纳米孔测序平台,开发一种高度并行的单分子RNA-seq方法,绕过逆转录和扩增步骤,同时能够检测RNA修饰。这种纳米孔测序平台是在RNA分子穿过纳米孔时检测它们,而不需要酶促合成反应。

(图片来自Nature Methods)

随后,研究人员利用MinION测序仪和R9.4流动槽,对酵母poly(A)+ RNA开展直接RNA测序。他们还利用MinION cDNA流程和Illumina 100 bp双端测序流程对相同的样本进行测序。他们发现,直接RNA的数据和cDNA的数据有着最高的相关性,同时两种纳米孔数据与Illumina数据的相关性类似。此外,直接RNA测序的基因覆盖度与Illumina的结果非常吻合。

作者认为,与其他RNA-seq策略相比,直接的RNA-seq方法有许多潜在优势,包括:它无需扩增,不会存在PCR或逆转录的偏倚;产生非常长的序列,对剪接变体的研究特别有用;直接测定RNA,可检测核苷类似物;它是链特异性的。不过,他们也认为这种方法需要进一步改进,以便提高碱基检出的准确性并兼容降解的RNA。(生物通 薄荷)

原文检索

Highly parallel direct RNA sequencing on an array of nanopores

Nature Methods
doi:10.1038/nmeth.4577

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