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专家指南:如何评估细胞的健康状况?(下)

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年1月26日 来源:生物通

摘要:

  对于生物学研究而言,细胞是不可或缺的一部分。当然,细胞首先要健康,高品质的实验结果才能有保证。那么,如何评估细胞的健康?Biocompare此次请来了六位专家,与我们分享他们的知识和经验,以帮助您获得可靠的实验结果。

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对于生物学研究而言,细胞是不可或缺的一部分。当然,细胞首先要健康,高品质的实验结果才能有保证。那么,如何评估细胞的健康?Biocompare此次请来了六位专家,与我们分享他们的知识和经验,以帮助您获得可靠的实验结果。

专家小组的成员包括:
▪ Bio-Rad的产品经理Mike Blundell博士
▪ MilliporeSigma的主管Klaus Bischoff
▪ Promega的产品经理Pam Guthmiller
▪ ImmmunoChemistry Technologies的研发主管Tracy Murphy
▪ ATCC Cell Systems的高级主管Robert Newman
▪ Essen BioScience(赛多利斯)的研发科学家Kalpana Patel

专家指南:如何评估细胞的健康状况?(上)

3. 细胞健康需要多久评估一次,哪些特殊情况需要评估?

Bischoff:一般来说,在传代细胞之前需要测定细胞的浓度和活力。当培养物老化时,监控细胞健康也很重要,因为细胞系的特征也在随之变化。如果细胞准备用于检测,那么最好在检测前一天和检测当天评估细胞浓度和活力。

Murphy:许多参数(比如生长、形态)很容易监控,应当定期/持续开展。在开始重要实验之前,或者其他参数显示细胞可能有问题,那么应当考虑更具体的检测,如使用活细胞/死细胞染色,或caspase的荧光抑制剂(FLICA)。具体方法要取决于细胞系,因为有些细胞更加敏感。

Patel:人们一般是在传代或接种细胞时,利用台盼蓝来评估细胞活力。这种方法虽然有用,但也只是粗略地测定某个时间点的活细胞/死细胞比例。更多的时候,研究人员想了解健康状况的时间点是无法检测的。因此,若评估已成为日常培养过程的一部分,相信会有所帮助。

至于多久评估一次细胞健康,这并没有固定的说法。当然,在重要事件发生时,比如细胞接种,建议进行评估。如果细胞是你不熟悉的类型,或者它们容易分化,如原代细胞,则更应该定期评估。活细胞分析实现了非侵入性的评估,因此应成为标准培养流程的一部分。

4. 您是否能分享一些技巧或产品,帮助大家准确高效地评估细胞健康?

Blundell:最简单的方法是使用不可固定的DNA结合染料,如PI、7-AAD或DAPI。在使用这些染料时,只需将它们添加到细胞悬液中并分析:带有完整细胞膜的细胞不会发出荧光。不过这些染料也有缺点:它们不能被固定,多色分析的空间也有限。

现在也有一些可固定的细胞活力染料,如VivaFix™ Cell Viability Assay。事实上,它们提供一系列范围广泛的激发和发射光谱,适用于大多数的仪器,为实验增添了灵活性。这些染料也适用于免疫荧光显微镜。

在使用试剂时,最好是按照说明书,使用正确的缓冲液。别忘了对照。如果你在进行多色实验,记得使用补偿对照。你可能需要阳性对照和阴性对照,来查看整个范围的细胞反应。阴性对照可选择重悬试剂的溶液。

此外,在实验中要选择合适的试剂。比如,测定凋亡的方式有很多种。如果你不确定某条通路work或你不想测定具体的通路,那么可选择通用的试剂。Caspase FLICA™ Apoptosis Detection Kit就能够检测几乎所有哺乳动物细胞中的各种caspase,它们有四种不同形式可供选择。相反,Caspase-9 FLICA Kit只适合凋亡的特定阶段。

Bischoff:MilliporeSigma提供了简便易用的分析,适合各种类型的细胞。我们的Muse细胞分析仪和Guava easyCyte仪器提供了“混合-读取”形式的分析,只需10 μL的细胞样品。Muse细胞分析仪是一个封闭的平台,有25种经过优化的分析,涵盖细胞健康的各个领域;Guava则是一个开放的系统,最多具有三个激光器,适用于单管或平板的检测。

Guthmiller:最佳方法取决于很多因素,包括你试图测定的内容、拥有的仪器、你的样品类型以及所需通量。许多商业化的分析以微孔板的形式评估细胞健康。对于简单的细胞是/否健康的实验,人们通常用四唑盐(MTT、MTS)或刃天青染料将细胞转化为读板机可检测到的彩色或荧光产物。不过,这些方法可能具有毒性,容易受到干扰。

对于珍贵的样品或关键的应用,或通量更高的实验,检测ATP的方法最为简单,因为它们的操作方案只是简单的“加样-混合-测定”,在10分钟内就能提供数据。而且,它们更加灵敏,需要的细胞量更少,适合高通量的小型化实验。

此外,也可以利用实时分析来监控细胞活力、毒性或凋亡,如RealTime-Glo™ Viability Assay或RealTime-Glo Annexin V Apoptosis and Necrosis Assay,从而轻松确定细胞的最佳参数,或确定最佳的处理时间和浓度。监控培养基中营养物浓度的变化和细胞产生的代谢物,可以深入了解代谢的变化。

Murphy:ICT的Necrosis vs. Apoptosis Assay为同时检测细胞凋亡和坏死提供了一种方便的方法。此试剂盒结合了一种红色的活细胞/死细胞染料(7-AAD)和一种绿色的caspase检测试剂(FAM-FLICA)。凋亡细胞表现为FAM-FLICA阳性(绿色),坏死细胞表现为7-AAD阳性(红色),两种均为阳性的是晚期凋亡细胞。

如果你担心那些更轻微的健康状况,它们不会快速演变为细胞凋亡或坏死的状态,但又影响到实验,那么ICT的JC-1或TMRM/TMRE荧光线粒体膜电位检测试剂盒也许是比较理想的选择。

(http://www.ebiotrade.com/)
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