单细胞建库技术SMART®-Seq HT Kit

【字体: 时间:2018年12月12日 来源:Takara

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  Takara公司拥有核心专利SMART技术,在2011年即推出了可以高灵敏度在单细胞水平上分析差异表达、融合基因、可变剪接,并提供全长信息的cDNA制备试剂。而升级的SMART-Seq HT Kit不仅做到操作时间大大缩短,而且可以检测到比以往更多的基因。

NGS技术的出现,使得对RNA的研究变得更为容易,而对于单细胞进行转录组文库分析也日益增长。

但是,单细胞转录组分析方法那么多怎么破,想要快点做完实验发paper!还能等到那一天吗(哭戚戚)?作为曾经的一只科研狗,小编想说您的痛我都懂,不能给您一个大大的拥抱,那么就让这款神器-SMART-Seq HT Kit轻松搞定~和小编一起来了解它的神技能吧!

神技能之靠谱的背景:Takara公司拥有核心专利SMART技术,在2011年即推出了可以高灵敏度在单细胞水平上分析差异表达、融合基因、可变剪接,并提供全长信息的cDNA制备试剂。而升级的SMART-Seq HT Kit,旨在以高通量的方式从1-100个细胞或10 pg-1 ng总RNA制备高品质的全长cDNA。

神技能之快速的操作:SMART-Seq HT Kit具有简化的操作流程,将原有的反转录和PCR扩增步骤整合为一步,且不影响性能。细胞分离或RNA提取后,仅通过一步RT-PCR扩增双链cDNA,然后进行纯化完成操作。cDNA合成可在4小时内完成,整个文库构建方案可在2天内完成。

神技能之卓越的性能:SMART-Seq HT Kit以Oligo(dT)引物起始,可以从高品质总RNA(RIN> 8)或完整细胞中特异性扩增mRNA。通过采用LNA技术,提升了模板转换效率,这使得使用本试剂可以检测到比任何以往SMARTer Ultra Low更多的基因,同时具有与SMART-Seq v4试剂盒相同的灵敏度和可重复性。

下面就详细了解一下它的特点吧!

SMART-Seq v4与SMART-Seq HT操作流程比较

SMART-Seq HT(右)是由SMART-Seq v4方法(左)经过改进而来的一个手动操作时间更短的高通量工作流程。使用FACS方法获得单细胞,SMART-Seq HT试剂盒只需3个操作步骤即可制备cDNA,工作流程的一个重要步骤是使用一步RT-PCR进行高效的反转录和PCR扩增cDNA的过程。一步RT-PCR缓冲液与AMPure bead纯化兼容,无需添加裂解缓冲液。

SMART-Seq v4与SMART-Seq HT之间的重复性分析

使用SMART-Seq v4试剂盒(SSv4_1-SSv4_12)和SMART-Seq HT试剂盒( HT_1-HT_9)(上图)从21个293T细胞制备单细胞文库,并对每个细胞获得的基因表达性进行评估。层次聚类热图展示了所有细胞之间的Euclidean distances,并显示从0.74到0.97的Pearson相关性。不仅用相同试剂盒制备的细胞之间可以观察到非常高的相关性,而在两种试剂盒之间的相关性也非常高。这些数据表明,SMART-Seq HT的工作流程与SMART-Seq v4相比,在基因表达分析中没有显著的偏差。

SMART-Seq v4与SMART-Seq HT针对不同GC含量基因的表达水平分析

针对10 pg小鼠脑总RNA样本,分别使用SMART-Seq v4和SMART-Seq HT试剂盒制备文库,分析文库的GC含量表达情况(Panel A)。通过GC含量对基因进行分类,并利用散点图显示每个分类中基因的表达水平(FPKM)的重现性。使用SMART-Seq v4(Panel B)或SMART-Seq HT试剂盒(Panel C)分析,基因表达水平显示重复之间的非常高的重现性。GC含量高或低的基因(分别以红色和蓝色显示)在SMART-Seq v4和SMART-Seq HT试剂盒(Panel D)中显示相似的表达水平。

SMART-Seq v4和SMART-Seq HT鉴定的转录本高度重叠

使用10 pg小鼠脑总RNA样本,分别使用SMART-Seq v4和SMART-Seq HT试剂盒制备文库,其中每个试剂盒做三个重复。分析每个试剂盒的三个重复之间检测到的转录本数目(FPKM> 0.1)的重叠情况,发现非常相似(SMART- Seq v 4:61%,SMART-Seq HT:63%)(Panel B)。此外,对这两个试剂盒之间的所有重复的转录本进行比较,表明重叠比例为71%,重叠转录本的平均表达水平为37个FPKM。但在每个试剂盒中检测到的非重叠转录本,平均表达水平为6-7个FPKM,均较低。这也表明,低水平表达的转录本不易被识别。

(以上数据均来源于Takara Bio Inc.)

这么简单,这么优质的单细胞转录组建库试剂盒,您不心动吗?

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