只需5分钟，快速准确地定量蛋白质

BCA法是最常用的蛋白定量方法之一，但有同学吐槽，“30分钟的孵育时间太长了”。的确，在核酸定量无需一分钟的前提下，蛋白质定量却要在37°C下孵育30分钟，或在室温下孵育2小时，的确显得太过漫长。

　　

在蛋白质的提取、纯化和分析过程中，蛋白质的定量随处可见。比如在裂解细胞之后，我们对各个样品中的蛋白进行定量，方便下游应用中的平行比较；而在蛋白电泳之前，我们也需要准确定量，以免精心准备的电泳（特别是2D电泳）抱憾而归。鉴于不同的蛋白样品中可能存在各种各样的（干扰）组分，测定蛋白浓度的方法也有许多种。

最简单的方法是测定蛋白样品在280 nm处的紫外吸光度。带有芳香族侧链的氨基酸（即酪氨酸、色氨酸）表现出强烈的紫外线吸收，故通过测定A280可以确定蛋白浓度。然而，这种方法虽然简单，却不太可靠，因为每种蛋白质的氨基酸组成并不同。此外，许多在280 nm处有光吸收的物质也会造成干扰，如核酸、小分子物质和某些去污剂。因此，这种方法多用于纯化的蛋白质的定量。

对于未完全纯化的蛋白、低丰度蛋白或细胞裂解液的浓度测定，基于试剂的蛋白定量方法就成为首选。在蛋白样品中加入定量试剂，在适当的波长下监测样品的颜色变化，并与已知浓度的对照蛋白质进行对比，即可测定蛋白质的浓度。

为何选择BCA？

BCA法就是近年来最常用的方法之一，目前Google学术搜索已有14万条结果。这种方法又被称为Smith法，因为它是由Pierce公司的Paul K. Smith等人在1985年发明的。后来，Pierce公司被赛默飞世尔科技公司收购。当然，这是后话。

BCA法的基本原理是，蛋白质在碱性环境下与Cu²⁺络合，并将Cu²⁺还原为Cu¹⁺。通过两个BCA分子与还原态Cu¹⁺的螯合，可形成紫色的显色反应产物（图1）。该产物在562 nm处有较高的吸光值，并与蛋白质浓度呈正比。

图1：BCA分子与一价铜离子的反应

与Bradford或Lowry等方法相比，BCA法对去垢剂的兼容性更强。它与多数离子型或非离子型去垢剂兼容，也是膜蛋白检测的首选方法。常用浓度的去垢剂，比如SDS、Triton X-100、Tween 20等，都不影响检测结果。还原剂、螯合剂以及强酸或强碱，则会干扰Cu²⁺的还原反应。

此外，BCA法有着高度的均一性。相对于Bradford染料结合方法而言，不同蛋白质之间的变异性更小。它还具有高的线性度，BSA的线性范围在20至2000 µg/mL。即使是低至5 µg/mL的样品，通过改良操作也能灵敏检测。不知道如何改良？那可以试试赛默飞的Micro BCA Protein Assay Kit，它是专为检测稀释样品的蛋白浓度（0.5-20 µg/mL）而设计的。

不过，有同学吐槽，“30分钟的孵育时间太长了”。的确，在核酸定量无需一分钟的前提下，蛋白质定量却要在37°C下孵育30分钟，或在室温下孵育2小时，的确显得太过漫长。如果经常要定量蛋白质，这个时间成本可伤不起。

快一点，再快一点

基于这个理由，赛默飞推出了全新的Pierce™ Rapid Gold BCA蛋白定量试剂盒。顾名思义，它能够更省时。现在，只需在室温下孵育5分钟，并在480 nm下测定，即可获得准确的定量结果（图2）。

图2. Pierce Rapid Gold BCA试剂盒的检测流程

Pierce Rapid Gold BCA试剂盒的原理与标准BCA法相同，也是基于Cu²⁺的还原反应和BCA与Cu¹⁺的螯合。不过，反应产物是橙金色复合物，在480 nm处有强烈的光吸收。与标准方法相比，它有着同样的线性范围，可以定量20至2000 µg/mL的蛋白质。在去垢剂兼容性和定量均一性方面，它的表现也是同样出色（图3）。

重点来了！它只需在室温下孵育5分钟哦，不需要准备水浴箱，也不需要等待半小时。同时，需要的样品量较少。每次分析只需20 μL，而标准BCA分析是25 μL。它可用来评估细胞裂解液的蛋白产量，预计膜蛋白的回收率，以及在工业应用中监控蛋白污染。

图3. 利用标准的Pierce BCA Protein Assay和Pierce Rapid Gold BCA Protein Assay测定细胞裂解液中的蛋白质浓度。

当然，没有一种测定蛋白质浓度的方法是完美的，因为每种方法都会受到不同条件的影响，如缓冲液组分的干扰，紫外吸收实验中的杂质蛋白等。我们在选择定量方法时应考虑：与缓冲液组分的兼容性、蛋白质之间的均一性、检测范围、速度和便利性等因素。如果蛋白质浓度对研究非常重要，建议对比分析多种定量方法的结果。

关于BCA蛋白定量方法，大家可能也有一些疑问。在此我们整理了一些Q&A，与大家分享。

Q. 哪些物质会干扰BCA定量分析的结果？

A. 部分干扰 BCA 定量分析的物质包括还原性物质、螯合剂以及强酸或强碱，即使浓度很低也可能会影响定量的结果：

维生素C	EGTA	铁离子	低纯度蔗糖
儿茶酚胺	低纯度甘油	脂类	色氨酸
肌酐	过氧化氢	蜜二糖	酪氨酸
半胱氨酸	酰肼	酚红	尿酸

另外，一些物质对 BCA 定量分析方法的干扰程度较低，当其在原始样本中含量低于某特定浓度时，仅对结果造成微小影响（可耐受）。此外，多种干扰物质可能产生加和作用，例如当样本缓冲液中含有多种干扰物质时，即使其中单一干扰物质的浓度低于可兼容浓度，总体仍有可能对蛋白质的定量分析产生干扰。

Q. BCA法与Bradford法应如何选择？

A. 主要由样品中的干扰物质决定。如果你的蛋白抽提试剂中含有大量去垢剂且不含有螯合剂、还原剂时，可使用BCA法；如果你的蛋白样品里含有EDTA等金属螯合剂或含有还原型物质，且不含有去垢剂时，可使用Bradford法。

Q. 蛋白抽提完是否可以直接蛋白定量？

A. 根据测试过的数据，Thermo Scientific M-PER、RIPA总蛋白抽提试剂、Mem-PER Plus膜蛋白抽提试剂、NE-PER核蛋白抽提试剂、亚细胞组分分离试剂盒等均可直接使用BCA进行蛋白定量，T-PER抽提后的蛋白经过稀释可使用BCA进行定量。

Q. BCA法能检测多肽浓度吗？

A. 不能，检测多肽浓度需要用专门的多肽浓度检测试剂盒，如Pierce™ Quantitative Fluorometric Peptide Assay（货号23290），或Pierce™ Quantitative Colorimetric Peptide Assay（货号23275）。

（生物通 余亮）