应用Capturem™技术优化抗体药物DMPK研究流程

【字体: 时间:2018年12月06日 来源:Takara

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  Takara公司独家提供应用新型膜技术的Capturem™ protein A 96 well和Capturem™ protein G 96 well高通量抗体快速纯化板,以及在质谱检测前,用于蛋白质样品快速酶解消化的柱式Capturem™ Trypsin和Capturem™ Pepsin试剂盒,为从事抗体药物DMPK的研发人员提供新思路和新方法!

在如今的生物药物领域,生物制剂如重组蛋白质、单克隆抗体的开发呈现出快速增长的趋势。因此尽快开发出生物基质样品(例如血浆)中蛋白质类治疗药物的检测方法,对阐明其在动物与人体的药代动力学(PK)与毒理学性质至关重要。

传统的免疫分析法应用于蛋白质药物检测,具有灵敏度高特异性强的优点,但也有不足,例如线性范围窄、基质干扰以及相对较长的方法开发周期(可能需要2-3个月)等。

近年来,随着LC-MS/MS技术在蛋白质类药物生物分析领域的应用,已可将方法开发周期缩短为1周,同时该技术还具备专属性强、线性范围较宽、精密度及准确度高和功能丰富等优点。以对血浆中蛋白质类药物进行LC-MS/MS检测为例,一般使用的生物分析方法流程大致如下:

方法开发

分析过程

在上述研究流程中,大规模目的蛋白质的富集和蛋白质样品消化通常是限速步骤,Takara公司的Capturem™技术一改传统设计,创新性运用多孔薄膜作为基质偶联相应的配基,在高通量(96 well)样品处理时仅需15 min即可完成,刷新了人们对质谱样品处理步骤的一贯认知,为药物研发过程中的DMPK检测提供高通量、快速的解决方案!

目的蛋白质的富集

Protein A和Protein G是细菌的胞壁蛋白质,能够特异性的与IgG的Fc片段结合。这一结合非常牢固,但其结合力却受pH的影响,抗体-protein A/protein G的亲和力会随着pH值的降低而急剧降低,应用protein A和protein G亲和纯化抗体就是基于此原理。

市售的传统产品包括偶联有protein A或protein G的凝胶树脂或磁珠,纯化抗体时,将样品与纯化介质混合或上柱孵育,之后进行常规的洗涤和纯化步骤分离得到抗体,再进行酶解消化处理和LC-MS/MS分析,这也是从事制备或下游工艺放大的研究人员比较常规的选择。但是对于从事抗体药物DMPK研究的工作人员来说,面临的是样品量小,但数量庞大的严峻挑战,常规树脂纯化方法预处理和纯化时间长,柱床体积大,并且对操作环境和操作设备都有较高要求,不便于开展大规模低量样品的筛选和验证性实验,即使是选择操作较为简便、耗时较短的磁珠纯化法,也难以避免实验前要对磁珠进行分装、预处理,实验中要进行的孵育以及频繁的移液操作,在进行高通量实验时,人力和时间仍是捉襟见肘!

Takara公司独家提供应用新型膜技术的Capturem™ protein A 96 well和Capturem™ protein G 96 well高通量抗体快速纯化板,为从事抗体药物DMPK的研发人员提供新思路和新方法!

技术原理:

“Capturem”是“Capture”和“membrane”两个词的巧妙组合,即“具有捕获能力的膜”。Capturem™膜技术的基本原理与传统树脂是相同的,都是通过protein A或protein G与抗体的亲和作用实现分离纯化,不同的是基质的设计,传统的树脂将配基偶联于琼脂糖凝胶,而Capturem™膜技术是将配基固定在具有多孔结构的膜上,通过对膜的改造,使其内表面积增大,能够固定更多的配基,因而对目的蛋白质/抗体具有更强的结合能力,相当于或高于75 mg/cm3树脂。

产品特点及主要参数

▪ 操作简单,室温下离心机操作即可
▪ 速度快,纯化操作从上样到洗脱结束仅需15 min即可完成
▪ 通量高,一次性可完成96 well的样品纯化
▪ 均一性好,纯化结果呈良好的线性关系

 

注:96 well 规格的产品需要96孔板使用的离心机或真空过滤装置。

实验例

Capturem™膜技术把纯化介质由一定体积的树脂变成一层薄膜,大大的压缩了柱床体积,样品可快速通过介质,降低了变性和扩散的风险。等体积的洗涤液对膜的洗涤效果更加彻底,并可实现高浓度、高纯度洗脱。下图是以人血清样品为例,对比Capturem™膜技术和传统树脂方法的纯化效果,结果显示,Capturem™膜技术纯化产物中的杂质白蛋白(Albumin)含量更低,这大大降低了后续酶解消化、LC分离和质谱分析的负担。

注:由于protein A和protein G对于不同类型的抗体结合能力存在差异,因此需要根据目标抗体的性质进行选择。除了抗体纯化,Takara公司还提供用于his-tag重组蛋白质高通量快速纯化的Capturem™产品(Code No. 635714),请查询官网www.takarabiomed.com.cn了解详情。

样品蛋白质的酶解消化

为了获得样品中待测蛋白质的信号肽,需要使用蛋白酶(如胰蛋白酶)对样品进行消化,将其中的蛋白质分解成为多肽。蛋白酶消化的一般过程包括使用尿素或盐酸胍对蛋白质进行变性处理、使用二硫苏糖醇(DTT)对蛋白质进行还原处理、再使用碘乙酰胺(IAA)对变性还原成为一级结构的蛋白质进行烷基化处理,最后加入酶孵育。其中酶解过程的成功与否对接下来的LC-MS/MS分析非常重要,因为产生的信号肽的多少以及长短会直接影响到检测方法的准确性和灵敏度。传统的酶解方法是溶液法,即将样品与一定浓度的胰蛋白酶混合,在37℃进行数小时甚至过夜的孵育。这种方法操作简单,成本低,但是可能会存在胰蛋白酶自身降解或对目的蛋白质过度消化的问题,并且耗时较长,容易成为整个质谱分析的限速步骤。

Takara公司独家提供Capturem™ Trypsin Miniprep Kit和Capturem™ Pepsin Miniprep Kit一次性小型离心柱试剂盒,应用Capturem™新型膜技术,膜上固定的是胰蛋白酶(Trypsin)或胃蛋白酶(Pepsin),与传统的溶液法过夜处理相比,具有以下优势:

▪ 操作快速,2 min-3 min内即可酶解蛋白质样品,无需过夜处理
▪ 比溶液法效率更高,酶解更彻底,但又能避免过度消化
▪ 样品中蛋白酶自身降解片段更少,蛋白质非特异性修饰几率更低
▪ 可以使整个蛋白质组学分析流程更加连贯,实现更有效的肽和蛋白质的质谱鉴定

实验例

使用Capturem™膜技术的酶解消化操作可明显提高工作效率、节约时间成本,使整个LC-MS/MS检测流程更加流畅,以Capturem™ Trypsin为例对比其与溶液法的效率差别如下:

使用Capturem™ Trypsin可以实现快速完全的Apomyoglobin(Apo)酶解。上图为使用RP-HPLC分析Capturem™ Trypsin和常规溶液法酶解蛋白质的结果,图A为未酶解的完整蛋白质,图B为溶液法室温酶解16 h的蛋白质,图C为使用Capturem™ Trypsin酶解1 min的蛋白质,结果显示使用Capturem™ Trypsin的酶解非常彻底。

抗体药物DMPK研究样本量庞大,所以选择准确性高、重复性好的方法对于获得真实可靠的实验数据是至关重要的。以Capturem™ Typsin为例,选择不同批次的产品验证其稳定性和重复性,结果显示,Capturem™技术可以满足DMPK研究中数量庞大的样品对酶解消化处理稳定性和重复性的要求,是实现高通量和自动化检测的必要前提。

不同批次的Capturem™ Trypsin消化产物HPLC图谱比较。使用80 μg的Apo,选择3个不同批次的Capturem™ Trypsin在天然条件下对其进行消化,HPLC结果显示三组消化产物具有相同的片段,说明Capturem™ Trypsin具有良好的重复性。

酶的自身降解以及对目标蛋白质的过度消化是溶液法处理样品时常会遇到的问题。酶的自身降解会导致图谱中出现不同程度的高强度胰蛋白酶自身降解峰,可能会减弱目标肽段峰的强度,在二级质谱鉴定时无法获得较好的离子碎片图谱;对目标蛋白质的过度消化会产生过多的小肽段,降低信号肽的特异性,影响最终的检测和分析结果。而Capturem™技术因其膜结构的设计,有着处理时间短、酶与样品接触充分的优势,所得到的肽段更长,特异性更好,并且分布均匀,色谱峰没有过度重叠的现象。
 

Capturem™ Pepsin与pepsin溶液法消化结果比较。对50 μg 的anti-HER2单克隆抗体(赫赛汀,曲妥珠单抗,人IgG1,κ链)使用3种方法进行酶解消化,分别是Capturem™ Pepsin,pepsin溶液法孵育4小时,pepsin溶液法孵育过夜。然后进行质谱分析。由上图可以看出,使用溶液法的消化产物峰左移并且总体峰的数量较多,说明产生了过度消化,而使用Capturem™ Pepsin则没有这个问题。

重要通知:Capturem™ 96-well trypsin plate即将上市,可在10 min内进行高通量的蛋白质酶解消化操作,并且具备良好的孔间重复性,敬请期待!

Capturem™的荣誉:

荣誉一
 
在瑞典6月9日举办的2016年重组蛋白质技术讨论会上,Takara Bio USA, Inc.新推出的Capturem™ Protein A技术获得了ELRIG技术奖。

这个两天的会议集中探讨了使用重组蛋白质作为生物治疗药物和在药物研发试剂方面的最新进展。2016年的主题包括宿主-细胞工厂、基因组编辑和蛋白质工程。

荣誉二

2018年6月3日-7日,在第66届美国质谱年会(ASMS 2018)上,来自美国默克制药公司(Merck & Co., Inc.),默克研究所(Merck Research Labs, West Point, PA)药代动力学及药效动力学部门的Dr. Michelle R. Robinson及其团队在大会上发表了名为《Improving the Efficiency of Immunoaffinity Purification and Enzymatic Digestion of Monoclonal Antibodies Using Capturem Technology》的学术简报。

这篇简报中主要介绍了在LC-MS检测中,应用Capturem™技术进行免疫亲和纯化和酶消化处理将大大缩短实验操作时间,酶消化步骤由传统溶液法的4-18 hr缩短成3 min,即使是已经快到2 hr的自动免疫亲和纯化操作系统也被Capturem™令人惊讶的5 min轻松超越。除了操作的简便以及时间的显著缩短,在这项实验中,Capturem™还能够显著增加实验通量达10-20倍,为药物高通量筛选和验证提供了更高效的手段。

荣誉三

2018年10月17日,Takara Bio USA, Inc.的研发科学家Christian Hoppmann博士在第二十一届Clinical & Pharmaceutical Solutions through Analysis年度研讨会(CPSA USA 2018)上,以他所展示的Capturem™技术,获得了大会创新奖。

CPSA会议旨在跨越多学科推动创新技术和解决方案的产生,并提供有关临床和药物分析的最新观点和经验,重点关注当前行业趋势和相关主题。

由此可见,Capturem™膜技术在生物药物研发和生物分析领域的应用,大大缩短了药物在筛选和DMPK研究阶段的实验周期,为实现药物研发与疾病“赛跑”提供了可能!

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