CRISPR基因编辑后单核苷酸替换检测,就是这么简单!

【字体: 时间:2018年12月06日 来源:Takara

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  Guide-it™ SNP筛选试剂盒可通过简便的酶分析法,在数百个细胞克隆中轻松筛选出发生了单核苷酸编辑的细胞克隆。这种检测方法无偏好性,与Sanger测序法相比,同样准确,但速度更快,可以4 hr完成检测,不用苦苦等待测序结果。

基因编辑技术其中一个强大的应用,就是在特定的基因组位点导入核苷酸替换,去模拟与人类疾病相关的单核苷酸多态性(SNPs)或者产生终止密码子以实现准确的基因敲除。那么,问题来了:应该如何从数以百计的克隆中筛选出一个对单核苷酸进行了编辑的细胞克隆呢?这对研究人员来说无疑是一个挑战,尤其是在没有相应的表型的情况下。然而Takara公司推出的Guide-it SNP Screening Kit可以充分满足这个需求,让您在数百个细胞克隆中轻松筛选出发生了单核苷酸编辑的细胞克隆。

Guide-it SNP Screening Kit是通过简便的酶分析法来进行检测的,可以在96孔板中快速识别出基因编辑后的细胞克隆。整个操作流程简单快速,首先通过PCR扩增基因组靶标位点,之后使用识别特定结构的核酸内切酶进行酶切反应,然后读取荧光值就可以完成单核苷酸替换检测。无论所需要检测的核苷酸替换类型、细胞克隆的合子型或者靶标位点的基因序列如何,都可以使用这个方法进行检测。

以G>A替换(野生型鸟嘌呤编辑为腺嘌呤)为例,基因编辑后,分离单细胞并扩大培养成为克隆细胞系,提取其基因组DNA并进行PCR扩增,PCR产物会与两条不同的互补寡核苷酸——displacement oligo(绿色)和flap-probe oligo (深/浅紫色)进行杂交。根据基因编辑的结果,Oligos与PCR产物杂交后会形成下图两种结构中一种。

当基因编辑成功发生时,杂交产物为double-flap结构,Double-flap结构由Guide-it Flap Detector识别检出,Guide-it Flapase核酸酶特异性剪切并释放出flap,从而产生荧光信号。当没有发生基因编辑时,flap-probe oligo在靶标位点不会形成完全的碱基配对,会形成一个带有缺口的结构(上面),这个结构不能被Guide-it Flapase核酸酶剪切,也就不会产生荧光信号。通过这种方式,使用Guide-it SNP Screening Kit检测荧光信号就可以确认是否发生了预期的核苷酸替换。

也许,有人会问,这种检测方法是不是有一定的偏好性呢,是否可以检测所有可能的碱基替换呢?Takara利用Guide-it SNP Screening Kit在多个人类基因组位点对核苷酸替换进行检测,样品是从Coriell研究所获取的野生型或者发生了所标明的核苷酸替换的纯合子来源的基因组DNA,检测结果表明,所有的碱基替换均可以成功检测到,与野生型(橙色)和阴性对照(灰色)样品所获得的荧光信号相比,发生了所标明的核苷酸替换的纯合子(蓝色)样品产生了强荧光信号就可以说明这一点。

对此,Takara科学家也将这种检测方法与Sanger测序法进行了比较。他们分别使用了Guide-it SNP Screening Kit(柱形图)和Sanger测序法对来自于Coriell研究所的SNPs样品进行分析,这些样品在NCP1或者CFT基因组位点上携带了SNPs。Guide-it SNP Screening Kit可以准确分析确定哪些样品发生了单核苷酸替换,这些样品是纯合子还是杂合子。所有检测结果与Sanger测序结果是一致的(Sanger测序结果显示在柱形图下面)。

Guide-it SNP Screening Kit可以与Sanger测序法相媲美,并且,与Sanger测序法相比,Guide-it SNP Screening Kit却拥有更快的速度,它可以4 hr完成检测,不用苦苦等待测序结果。

这样的检测方法很简单,无需进行测序也可以轻松检测出基因组中的单核苷酸替换突变。不论您的研究领域是CRISPR单核苷酸替换编辑还是高通量SNP筛选,Takara公司的Guide-it SNP Screening Kit都可以让检测变得简单起来。

更多详细信息请点击:Guide-it™ SNP Screening Kit                                          

 


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