CRISPR实验指南:如何检测CRISPR脱靶突变(二)

【字体: 时间:2018年03月28日 来源:生物通

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  这些检测方法通常非常敏感,可以检测到突变频率低于0.1%的脱靶位点,因此适用于大规模筛选,分析脱靶效应,或通过从患者中提取基因组DNA,用于临床分析。但是因为这些方法采用的是无细胞基因组DNA,所以无法预测细胞内发生的突变。

  

CRISPR实验指南:如何检测CRISPR脱靶突变(一)


CRISPR能帮助研究人员快速有效地对基因组进行有针对性的切割。它的特异性和易用性使其成为了颇具潜力的工具,可用于去除缺陷基因,治疗遗传疾病或癌症,编辑作物的基因组增加其产量或抗病性等。

然而,研究人员也首先必须克服CRISPR的主要限制之一:不仅在其目标位置切割,而且在具有相似序列的非预期位置上也会进行切割。这些脱靶切割可能发生在整个基因组中,导致产生损害细胞功能或直接杀死细胞的有害突变。

要想研发检测CRISPR脱靶突变的方法并不容易,但在过去几年中,研究人员提出了各种新方法。The Scientist杂志最新介绍了这些方法。

体外全基因组检测

当Cas9和其它类似的核酸酶切割基因组时,它们会导致双链断裂。大多数确定脱靶效应的体外试验采用Cas9或其它核酸酶切割无细胞基因组DNA,然后使用软件检测测序数据中的双链断裂。

这些检测方法通常非常敏感,可以检测到突变频率低于0.1%的脱靶位点,因此适用于大规模筛选,分析脱靶效应,或通过从患者中提取基因组DNA,用于临床分析。但是因为这些方法采用的是无细胞基因组DNA,所以无法预测细胞内发生的突变。

Digested genome sequencing( Digenome-seq )自2015年推出的一种体外检测方法,现在被应用于越来越多的研究中。它有简单的两步:体外Cas9切割,然后进行二代测序。

另外两种较新的方法: CIRCLE-Seq 和 SITE-Seq 则稍微复杂一点(测序前需富集核酸酶切割的基因组DNA),但灵敏度也更高。研究人员希望能提高这些方法的准确性和通量。

哈佛大学医学院病理学教授Keith Joung表示:“我认为从长远来看,体外研究将是一条可行之路,但现在还有待进一步完善”。

基于细胞的全基因组检测

这类检测脱靶的方法采用不同的技术,鉴定Cas9或其它核酸酶在细胞中裂解基因组DNA,并导致的双链断裂的位置。这种方法与体外方法相比的一个优点在于,它可以识别特定细胞类型和特定实验条件下的脱靶位点。

基于细胞的全基因组检测方法除了可以检测由CRISPR核酸酶产生的断裂,还可以检测内源性发生的双链断裂。其灵敏度根据所涉及细胞的特征而变化,包括培养和转染的容易程度,以及如何有效地修复双链断裂。

GUIDE-Seq是一种广泛使用且高度敏感的基于细胞的检测方法(生物通注),可以检测细胞群中发生频率为0.1%的脱靶位点。它的原理是通过小的双链寡核苷酸标记由Cas9或其他核酸酶产生的双链断裂,然后PCR扩增,并测序绘制出双链断裂 GUIDE-Seq的一个缺点是一些原代细胞难以用寡核苷酸转染。

线性扩增介导的高通量全基因组易位测序(LAM-HTGTS)检测的就不仅仅是断裂了,它能识别由这些断裂导致的基因组重排。

大多数由Cas9核酸酶切割的双链断裂能主动修复自身,但还有一些会融合到由其他双链断裂产生的末端,从而导致脱靶和断靶的染色体易位。LAM-HTGTS可以检测到这些易位,还有其它的一些脱靶编辑,包括它们对基因组不稳定性的影响。

“利用这种分析方法,你可以检测到一个生物过程的最终事件,”斯坦福大学分子遗传学家 Richard Frock说。

由瑞典卡罗林斯卡研究所的Magda Bienko和Nicola Crosetto、麻省理工学院的Zhang和Yan合作开发的BLISS(Breaks Labeling In Situ and Sequencing)方法则是通过生物化学方法标记固定细胞中的双链断裂,从而直接捕获原代细胞中的断裂数量。

这种检测的灵敏度取决于收获细胞的时间,而且不同的组织可能具有不同的最佳收获点。

“我认为我们的检测方法在临床上有很大的应用潜力,因为它可以检测自然环境中的断裂情况,”Crosetto说。

(生物通)

CRISPR实验指南:如何检测CRISPR脱靶突变(三)




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