细胞计数,你真的不必亲自动手

【字体: 时间:2018年04月17日 来源:生物通

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  过去十年,随着越来越多的自动细胞计数器上市,入门型号的价格也在不断下降,这使得更多的实验室能够亲身体验。同时,多功能的细胞计数器也在不断推出,为人们带来多样化的选择。

  

天天与细胞打交道,计数可是少不了的。手动计数是以往最常用也是最经济的方法。不过,在显微镜上观察个把小时,即使是再美的细胞也会疲劳。不仅审美疲劳,脖子和眼睛都很疲劳。这时,您除了需要一次“马杀鸡”,还需要一台自动细胞计数器。

与头晕眼花的手动计数相比,自动化细胞计数器不仅带来了更轻松的体验,也带来了更准确的结果。这些设备大多在短短几十秒的时间内,对特定区域内的细胞进行多次计数并取平均值。有些还利用染料排除法来区分活细胞和死细胞,并提供细胞大小等统计信息。在大大提高效率的同时,也避免了A同学和B同学之间的差异。

过去十年,随着越来越多的自动细胞计数器上市,入门型号的价格也在不断下降,这使得更多的实验室能够亲身体验。同时,多功能的细胞计数器也在不断推出,为人们带来多样化的选择。

我只想安安静静地计数

针对常规的细胞计数,许多公司推出了小巧易用的细胞计数器,也收获了广大用户的好评,包括赛默飞世尔、Bio-Rad、默克等。如今,许多热门仪器都升级到第二代。

赛默飞的Countess II采用台盼蓝染色原理,利用自动对焦和图像分析算法获得精确的细胞计数。在插入玻片后,它自动对细胞进行对焦,从而避免了手动对焦带来的人为波动。细胞成团成块?这也不是问题。Countess II的先进算法可以清晰判定细胞块内的细胞边界,因此即使是成团块样品,也不必担心结果不准确。

Countess II自动细胞计数仪

Countess II须需要配合细胞计数板使用。这种计数板是一次性的,带有两个独立的小室,可对同一样品重复计数,也可对两个不同的样品计数。计数面积为3.48 mm2,是血球计数板1 mm2计数面积的约4倍。将10 µL 样品与10 µL 台盼蓝混合后,加样到细胞计数板中,插入仪器后按下按键即可。细胞浓度范围应在1x104 -1x107 细胞/ml,最好在1x105-4x106 细胞/ml,大小最好在5-60 µm。

Bio-Rad的TC20自动细胞计数器也是第二代的升级产品,保留了TC10的多平面自动对焦技术。它采用自动对焦显微镜,可分析多个焦平面来确定最佳平面。精密的细胞计数算法将根据最佳焦平面获取的图像来识别细胞并排除残骸,从而计算出细胞总数。在评估细胞活性时,选择自动对焦来代替主观的人工对焦就显得格外重要,因为如果选错了焦平面,将带来不准确的结果。

在分析由多种细胞组成的复杂样品时,如原代细胞,您可以对细胞大小进行设门,将感兴趣的群体设在门内。在计数多个重复样品时,TC20自动细胞计数器可以保存门的设置,并将它们用于后续的计数。

许多用户在使用TC20后,都给出了五星的好评。他们认为TC20简单易用,结果准确,几乎不需要培训即可使用,大大减少了细胞计数的主观性。不过,对于计数用的玻片,有人认为物有所值,有人则直呼太贵。

如果您需要一台便携的细胞计数器,那么默克的Scepter™2.0手持式细胞计数器一定能够满足您的需求。它采用小巧的移液枪式设计,可以充电使用,摆脱电源线的束缚。您可以将其放在超净台内使用,为无菌操作带来便利。因此,Scepter™2.0常常被人称为“魔杖”。

Scepter™2.0手持式细胞计数器

与前面提到的两个产品不同,计数采用的是库尔特原理。悬浮在电解液中的细胞随电解液通过小孔时,导致小孔内外两电极间电阻发生瞬间变化,产生电位脉冲。脉冲信号的大小和次数与颗粒的大小和数量成正比。因此,它可以监测细胞数量、细胞体积和直径。与图像法相比,这种计数方法更加准确,也更加快速。

在使用60 μm传感器,对浓度为5x105个细胞/mL的样品进行计数时,平均用时仅需14秒,相比之下,用血球计数器进行计数需要花费数十倍的时间。此外,Scepter™2.0的平均CV仅为9.1%,而血球计数器则高达41.8%。对于<6 μm的小颗粒,这种设备也能精确计数,不用担心与碎片杂质混淆。

当然,由于采用的是库尔特原理,通过小孔的任何颗粒都会被计数。不论是活细胞、死细胞,还是细胞碎片,都会被计算在内。不过死细胞会有明显的细胞体积胀大,而Scepter™2.0的结果是以直方图显示的,因此,你可以根据需要设置上下限,方便地排除细胞碎片和大部分死细胞。

我需要更高级的功能,或者说我的细胞更难搞

并非所有的细胞样品都是相同的。有些细胞是均质的,组成单一,无论放在哪种细胞计数器上都能有准确的结果;有些细胞来源于组织,背景复杂,那么计数时就得多费点心,因为明场计数不能区分有核细胞和无核细胞。对此,Nexcelom Bioscience建议使用荧光细胞分析仪,如Cellometer Auto 2000。

Cellometer Auto 2000

Cellometer Auto 2000是专为外周血、脐带血和骨髓中的原代细胞和复杂样品的分析而设计的。它配备双色荧光通道,能够对活的和死的有核细胞进行染色,因此在细胞碎片、血小板和红细胞存在的情况下也能产生准确的计数和存活率数据,更好地评估PBMC等细胞的健康。

它利用吖啶橙(AO)和碘化丙啶(PI)这两种荧光染料对细胞进行染色。AO是可以渗透活细胞和死细胞的核染色染料,将所有的有核细胞染成绿色。PI只能进入细胞膜受损的死细胞,将所有死的有核细胞染成红色。总结一下,绿色就是活的有核细胞,红色就是死的有核细胞。红细胞、血小板和碎片不发光,自然也就不会造成干扰。

加州大学洛杉矶分校(UCLA)分子诊断实验室的Tiffany Sidwell就正在使用Auto 2000分析仪。“我们经常对PBMC进行计数,并在冻存管中放入一定数量的细胞进行冷冻保存,”Sidwell说。“自从我们将Auto 2000引入实验室,细胞的存活率和计数变得更加可靠。”

赛默飞世尔的Countess II FL全自动细胞计数仪也带有类似的荧光功能。与普通的Countess II相比,它增加了两路荧光通道,可以进行细胞计数、荧光蛋白表达监控和细胞活力测定,也适用于背景复杂的细胞样品。

值得一提的是,Countess II FL的荧光通道并不是固定的。因为其荧光检测技术的核心是专利的EOVS LED光立方。每个光立方是相对独立的,含有一个LED、发光元件和滤光片。你可以根据实验要求,在Countess II FL上插上适当的光立方。即插即用,几乎不需要维护。目前有十多种光立方可供选择,可谓相当灵活。

例如,您想要测定利用RFP表达载体转染并带有蓝色细胞核染色的细胞的转染效率?没问题。只需安装RFP和DAPI光立方,就可以对总细胞和RFP表达细胞进行计数并精确测定转染效率。

针对大家经常吐槽的一次性计数板成本太高,Countess II FL此次在耗材上增加了一个选项,那就是可重复使用的细胞计数板。一些研究人员出于经济上的考虑,而不得不舍弃细胞计数仪。如今,您大可放心了。Countess II FL允许使用玻璃玻片,从而显著降低了长期的耗材成本。当然,一次性的计数板也照样能用。

立即索取Countess II/Countess II FL全自动细胞计数仪的更多技术资料

结语

赛默飞曾经算过一笔账,将手动计数(大约5分钟)与自动计数(大约10秒)所花费的时间成本进行比较。如果每人每天计数5块玻片(每块玻片上2个样品),在使用一次性玻片的情况下,每月可节省的时间长达15小时,相当于两个工作日啊。将这些时间花在更有意义的工作上,岂不快哉!(生物通 薄荷)

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