15分钟，如何实现完美的无缝克隆？

对于克隆，人们已不再满足于酶切和连接的传统方式。时间长，效率低，连接位置还留下了一道“疤”，这往往令追求完美的合成生物学家头疼。于是，无缝克隆的技术应运而生。最新一期的《BioTechniques》杂志就介绍了In-Fusion克隆技术。

In-Fusion克隆技术的基础是In-Fusion专利酶，此酶通过识别DNA片段和线性化载体末端的15 bp同源序列将片段和载体高效地融合在一起。您只需将目的片段和线性化载体与预混合酶试剂相混合，在50℃孵育15分钟就行了。

读到这里，您是不是联想到另一种克隆技术？没错，Gibson组装也是无缝克隆。两种技术有许多相似之处，都不需要酶切消化，操作过程简单快速，不会添加额外的碱基，并且一次能够克隆多个DNA片段。

那么，这两种克隆方法究竟孰优孰劣？研究人员在并行实验中进行了比较。他们采用pUC19克隆载体，并用BamHI线性化。之后，他们按照各自的克隆方案，插入了单个片段和多个片段。对于3个片段的组装，Gibson方案的孵育时间从15分钟增加到60分钟。最后使用菌落计数和克隆序列验证来评估每个反应的结果。

研究人员发现，对于单片段的克隆，In-Fusion技术的克隆准确性与预期一致。Gibson技术也表现出相当高的准确性。不过，对于阴性对照，Gibson方法也观察到不少菌落，这表明In-Fusion酶更加精确和可靠。

单片段的克隆：MBP (1.1 kb)

这种背景差异在多片段克隆中尤为明显。在插入多个片段时，In-Fusion克隆技术继续发挥高准确性的优势，阴性对照只有1个克隆，且克隆准确性达到100%。相比之下，Gibson克隆方法在15分钟时表现不佳，而时间延长到1小时后菌落明显增加，但假阳性菌落也增加。

多片段的克隆：MBP (1.1 kb)、PROF12 (0.7 kb)、AcGFP1 (0.7 kb)

由此看来，尽管两种方法都带来了准确的无缝克隆，但In-Fusion技术在背景、速度和整体准确性方面都是明显的赢家，尤其是在复杂的克隆项目中。研究人员期待每次都能获得正确的克隆，而In-Fusion技术可以实现这一点。

研究人员还指出，In-Fusion技术在克隆大载体方面有更多优势。Gibson方法可以使用20.5 kb的质粒，而In-Fusion技术可使用高达46 kb的粘粒。这意味着In-Fusion反应可取代包装系统，快速准确地组装大载体。

15分钟、没有背景的无缝克隆，这不正是您心目中的完美克隆吗？（生物通 薄荷）

原文检索

In-Fusion® Cloning: Accuracy, Not Background

BioTechniques, Vol. 64, No. 3, March 2018, pp. 128–130