15分钟,如何实现完美的无缝克隆?

【字体: 时间:2018年04月04日 来源:生物通

编辑推荐:

  对于克隆,人们已不再满足于酶切和连接的传统方式。时间长,效率低,连接位置还留下了一道“疤”,这往往令追求完美的合成生物学家头疼。于是,无缝克隆的技术应运而生。

对于克隆,人们已不再满足于酶切和连接的传统方式。时间长,效率低,连接位置还留下了一道“疤”,这往往令追求完美的合成生物学家头疼。于是,无缝克隆的技术应运而生。最新一期的《BioTechniques》杂志就介绍了In-Fusion克隆技术。

In-Fusion克隆技术的基础是In-Fusion专利酶,此酶通过识别DNA片段和线性化载体末端的15 bp同源序列将片段和载体高效地融合在一起。您只需将目的片段和线性化载体与预混合酶试剂相混合,在50℃孵育15分钟就行了。

读到这里,您是不是联想到另一种克隆技术?没错,Gibson组装也是无缝克隆。两种技术有许多相似之处,都不需要酶切消化,操作过程简单快速,不会添加额外的碱基,并且一次能够克隆多个DNA片段。

那么,这两种克隆方法究竟孰优孰劣?研究人员在并行实验中进行了比较。他们采用pUC19克隆载体,并用BamHI线性化。之后,他们按照各自的克隆方案,插入了单个片段和多个片段。对于3个片段的组装,Gibson方案的孵育时间从15分钟增加到60分钟。最后使用菌落计数和克隆序列验证来评估每个反应的结果。

研究人员发现,对于单片段的克隆,In-Fusion技术的克隆准确性与预期一致。Gibson技术也表现出相当高的准确性。不过,对于阴性对照,Gibson方法也观察到不少菌落,这表明In-Fusion酶更加精确和可靠。

单片段的克隆:MBP (1.1 kb)

这种背景差异在多片段克隆中尤为明显。在插入多个片段时,In-Fusion克隆技术继续发挥高准确性的优势,阴性对照只有1个克隆,且克隆准确性达到100%。相比之下,Gibson克隆方法在15分钟时表现不佳,而时间延长到1小时后菌落明显增加,但假阳性菌落也增加。

多片段的克隆:MBP (1.1 kb)、PROF12 (0.7 kb)、AcGFP1 (0.7 kb)

由此看来,尽管两种方法都带来了准确的无缝克隆,但In-Fusion技术在背景、速度和整体准确性方面都是明显的赢家,尤其是在复杂的克隆项目中。研究人员期待每次都能获得正确的克隆,而In-Fusion技术可以实现这一点。

研究人员还指出,In-Fusion技术在克隆大载体方面有更多优势。Gibson方法可以使用20.5 kb的质粒,而In-Fusion技术可使用高达46 kb的粘粒。这意味着In-Fusion反应可取代包装系统,快速准确地组装大载体。

15分钟、没有背景的无缝克隆,这不正是您心目中的完美克隆吗?(生物通 薄荷)

原文检索

In-Fusion® Cloning: Accuracy, Not Background

BioTechniques, Vol. 64, No. 3, March 2018, pp. 128–130

我来说两句
0  条评论    0 人次参与
登录 注册发布
最新评论刷新
查看更多评论 > >

订阅生物通快讯

订阅快讯:

最新文章

限时促销

会展信息

关注订阅号/掌握最新资讯

生物通首页 | 今日动态 | 生物通商城 | 人才市场 | 核心刊物 | 特价专栏 | 仪器龙虎榜

版权所有 生物通

Copyright© eBiotrade.com, All Rights Reserved

联系信箱:

粤ICP备09063491号