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你以为做完m6A测序后就完了?m6A-IP-qPCR了解下!

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年05月21日 来源:联川生物

摘要:

  所谓m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。

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今天的文章将围绕m6A测序后必须要了解的一种定量技术——m6A-IP-qPCR(也叫MeRIP-qPCR)。

所谓m6A-IP-qPCR也叫MeRIP-qPCR,即利用m6A抗体在富集到带甲基化修饰的RNA后,下一步使用qPCR直接对富集到的RNA进行定量的一种技术。

这种技术可以做到对发生甲基化的RNA进行相对定量,是一种低成本的检测方法,仅需m6A抗体,A/G免疫磁珠,磁力架和qPCR仪及配套试剂盒即可开展这类实验。

第一步:提取total RNA,作为可选步骤可以用OligodT磁珠富集带polyA尾的mRNA。
第二步:将A/G免疫磁珠和m6A抗体按照试剂盒的标准步骤进行预混,配制免疫磁珠抗体预混液。
第三步:将预混好的免疫磁珠m6A抗体加入total RNA或mRNA中,若RNA上的腺嘌呤上带有m6A甲基化修饰,则m6A抗体会与之相结合。
第四步:采用磁力架对m6A免疫磁珠进行富集。
第五步:用蛋白酶对富集到的RNA-抗体复合物进行消化,m6A抗体被消化完后只剩下RNA。
第六步:进入常规的qPCR的步骤。

当然这里需要注意的是,这类实验仅仅是对发生RNA甲基化的基因进行相对定量检测,甲基化程度高应该还要和基因本身的转录水平相结合。MeRIP-qPCR还需要结合其他实验,如常规的qPCR、WB等才能从多个角度来验证,最终得到想要的结果。

今天的内容分享完啦,大家记得收藏好慢慢学习哦~

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