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评估RNA完整性和质量的新方法[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年05月30日 来源:生物通

摘要:

  即使采用口碑极佳的试剂盒来提取RNA,也不能从此高枕无忧。由于RNase是无处不在的,RNA的质量并不能得到保证。出于这个原因,在处理的时候除了要小心再小心,还需要采用适当的方法对RNA进行质量控制。在此,我们介绍了一种新方法。

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俗话说,水是生命之源。套用这种说法,样品也是分析之源。RNA-Seq的结果如何,在很大程度上取决于RNA样品的质量。其实,不光是测序,许多下游应用都需要优质且完整的RNA,如芯片分析,gene editing,qRT-PCR等。这些实验的成本很高,周期也很长,若屡屡失败,恐怕很难跟老板交代。因此,必须从源头就控制好,减少不必要的尝试。

不过,即使采用口碑极佳的试剂盒来提取RNA,也不能从此高枕无忧。由于RNase是无处不在的,RNA的质量并不能得到保证。出于这个原因,在处理的时候除了要小心再小心,还需要采用适当的方法对RNA进行质量控制。

如何评估RNA的质量?方法倒是不少,分光光度法、凝胶电泳、毛细管电泳,这些都是大家常用的。当然,每种方法都各有千秋。

利用分光光度计,比如NanoDrop,人们只需要1 µL样品,即可快速测定RNA样品在230、260和280 nm下的OD值。利用A260可对RNA进行定量,而利用A260/A280可确定蛋白质污染,利用A260/A230可确定化合物污染,比如胍盐和苯酚。操作方便,结果清晰,深受大家喜爱。不过,它无法确定RNA的完整性,也不能给出大小或分布的信息。

于是,人们后续总会跑胶看个究竟。凝胶电泳就是一种直观的评估RNA完整性的方法。对于真核样品而言,完整的总RNA在凝胶电泳时会产生清晰的28S和18S rRNA条带,且28S条带的强度大约为18S条带的两倍。2:1,这是判断RNA完整性的一个很好的指标。部分降解的RNA样品电泳条带会弥散,或不会出现这种2:1的比例。这种方法成本低,但需要的样品量比较大,同时又不能反映足够多的细节。

之后,随着芯片分析的兴起,电泳也逐渐走入2.0时代,从凝胶电泳迈向毛细管电泳。人们开始用生物分析仪,如安捷伦科技的Agilent 2100 Bioanalyzer,对RNA样品进行定量及质量评估。它每次分析仅需要1 µL浓度为10 ng/µL的样品,并提供反映RNA降解程度的RIN值。此外,它还可以提供样品RNA浓度及纯度的评估。

这一切看上去很美,不过仪器和芯片的成本似乎有点高,而且样品制备和电泳也需要较长的时间。那么,有没有一种方法能够快速、准确且经济地评估RNA样品的完整性和质量?答案当然是肯定的。赛默飞世尔科技最近就推出了一种新的解决方案。

当年那个小巧的Qubit荧光计大家还有印象吧。如今,利用新上市的Qubit 4荧光计和Qubit RNA IQ Assay,只需简单的两步即可准确地区分完整RNA和降解RNA。无需特殊的处理,无需繁琐的制备,也无需漫长的等待。只需添加1 µL样品,5秒钟即可获得结果。

那么,检测原理如何?其实,Qubit RNA IQ Assay试剂盒采用一种巧妙的方法来判断RNA样品是否降解。它使用两种独特的染料:一种与完整或高度结构化的RNA结合,比如mRNA、tRNA和rRNA。另一种则选择性地与小的降解RNA结合。通过测定荧光强度,我们就能够快速评估RNA样品的质量和完整性。由于Agilent 2100 Bioanalyzer需要依赖核糖体RNA峰值来评估RNA质量,而Qubit法不需要,因此对于FFPE样品,Qubit法能获得更加准确的结果。

在使用过程中,您只需将1-20 µL样品与RNA IQ工作液混合,然后在Qubit 4荧光计上测定。检测结果以RNA IQ值表示,具体范围在1到10,比如下图显示的RNA IQ 8.5。这与其他RNA质量评分类似,数值越接近10表明样品完整性越高,反之,数值越小表明完整性越差。仪器界面上同时还显示样品中大RNA与小RNA的百分比。


 图1. Qubit 4荧光计和Qubit RNA IQ Assay的结果

操作的确很简单,想必大家更关心准确性如何。研究人员曾在100 ng/µL的rRNA溶液中加入750 fM RNase A,然后在各个时间点分别用Qubit RNA IQ Assay或Agilent Bioanalyzer仪器评估rRNA的完整性和质量。结果如下所示,Qubit RNA IQ Assay与金标准的微流体电泳方法有着很好的相关性。


图2. 在RNase处理后评估rRNA的完整性和质量

您看,只需投资少少,即可收获多多,轻松评估RNA的完整性和质量。与微流体电泳相比,样品制备的时间大大减少,至少节约了30分钟,分析时间也从30分钟缩短到5秒。同时,制备好的样品可在1小时内保持稳定,而不像芯片必须在5分钟内使用。

此外,Qubit 4荧光计不需要开机设置和定期维护,即开即用,相当方便。检测过程只需要检测管和RNA IQ试剂,而无需使用昂贵的芯片,实验成本可降低一半。不过,如果您希望获得详细的片段大小信息或RNA样品的分布信息,仍建议使用凝胶电泳或微流体电泳。

特别提醒一下,RNA IQ Assay只能在Qubit 4上运行,不适用于Qubit、Qubit 2或Qubit 3荧光计。Qubit 4荧光计不仅适用于RNA IQ Assay,同时适用于之前的各种Qubit定量分析,包括RNA定量、DNA定量和蛋白定量。

现在,您与RNA质控之间,只差一台Qubit 4啦。欢迎询价或申请试用>>

(生物通 余亮)

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