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Cas13d:一种小巧而强大的CRISPR核酸酶[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年05月09日 来源:生物通

摘要:

  近两年,靶向RNA的Cas13酶风靡了CRISPR世界。与RNA干扰类似,Cas13酶能够敲低RNA而不改变基因组,同时具有更高的on-target特异性。最近,两个研究小组发现了一种新的Cas13d酶,它只有2.8 kb,可以轻松包装到容量有限的载体中。

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近两年,靶向RNA的Cas13酶风靡了CRISPR世界。与RNA干扰类似,Cas13酶能够敲低RNA而不改变基因组,同时具有更高的on-target特异性。最近,两个研究小组发现了一种新的Cas13d酶,它只有2.8 kb,可以轻松包装到容量有限的载体中。

Cas13d酶是如何发现的呢?

大千世界,微生物无处不在,CRISPR自然也是多种多样。为了鉴定Cas13d酶,Salk生物研究所和Arbor Biotechnologies公司(张锋是创始人之一)的研究人员通过常用的生物信息学筛选,在推定的效应核酸酶附近寻找CRISPR重复序列。

他们鉴定出的Cas13d蛋白与之前发现的Cas13a-c同源物的序列相似度不高,但含有Cas13超家族特有的HEPN核酸结构域。Arbor Biotechnologies公司的Yan等人研究了来自惰性真杆菌的EsCas13d和瘤胃球菌属的RspCas13d,而Salk研究所的Konermann等人鉴定了来自厌氧消化宏基因组的AdmCas13d、黄色瘤胃球菌的CasRx以及EsCas13d。

Cas13d酶与其他Cas13有何不同?

与其他Cas13酶一样,这些Cas13d同源物能独立地将CRISPR序列加工成向导RNA。它们依赖crRNA来切割目标,而不依赖HEPN结构域。这些酶对目标的侧翼序列没有要求,因此您可以靶向任何RNA序列。

既然Cas13d在功能上与其他Cas13酶类似,那么它们有什么独特之处呢?关键在于大小。Cas13d酶的平均长度为930个氨基酸,比其他Cas13酶小20%,比Cas9更是小33%。这种尺寸使其更容易包装到容量较小的载体中,如腺相关病毒(AAV)载体。

Arbor Biotechnologies公司的Yan等人发现,RspCas13d的辅助蛋白RspWYL1增强了RspCas13d的RNA靶向和降解功能。RspWYL1蛋白同时也增强了EsCas13d的活性,表明含有WYL结构域的蛋白可能是Cas13d的活性调控元件。这种性质使得WYL蛋白成为anti-CRISPR蛋白的有趣对应物。

Salk研究所的Konermann等人则发现,与核定位信号(NLS)融合的CasRx和AdmCas13d能够在哺乳动物细胞中很好地发挥功能。他们在HEK293细胞中开展了mCherry报告基因检测,通过流式分析发现CasRx和AdmCas13d分别使mCherry蛋白活性减少了92%和87%。

他们还将CasRx与多种RNA调控方法进行比较,包括RNA干扰、dCas9介导的转录抑制(CRISPRi)以及Cas13a/Cas13b RNA敲低。结果发现,CasRx是明显的赢家,敲低效率为96%,而shRNA为65%、CRISPRi为53%,其他Cas13a和Cas13b大约在66-80%。此外,CasRx也表现出极高的on-target效率。shRNA处理产生500-900个明显的脱靶,而CasRx为零脱靶。

由于催化失活的dCasRx保留了RNA结合特性,Konermann等人测试了它通过外显子跳跃操控RNA的能力。他们以编码痴呆相关tau蛋白的MAPT基因为研究对象,导入dCasRx以实现选择性剪接。通过AAV载体导入iPS衍生的皮质神经元之后,dCasRx介导的外显子跳跃迅速调整了致病性与非致病性tau的比例,展示了dCasRx的临床应用前景。

眼下,这两项研究中的质粒都可以从Addgene处获得。未来,CRISPR工具箱有望进一步扩大,带给人们更多的选择。(生物通 薄荷)

参考文献

Konermann, Silvana, et al. “Transcriptome Engineering with RNA-Targeting Type VI-D CRISPR Effectors.” Cell (2018) pii: S0092-8674(18)30207-1.

Yan, Winston X., et al. “Cas13d Is a Compact RNA-Targeting Type VI CRISPR Effector Positively Modulated by a WYL-Domain-Containing Accessory Protein.” Mol Cell. (2018) pii: S1097-2765(18)30173-4.

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