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12款亚硫酸氢盐转化试剂盒,谁表现更出色?[心得点评]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年06月21日 来源:生物通

摘要:

  比利时根特大学的研究人员近日评估了12种亚硫酸氢盐试剂盒的表现。他们综合利用凝胶电泳、定量PCR、数字PCR以及新一代测序(NGS)等方法,寻找这些试剂盒之间的差异。评估结果于上周发表在《PLOS One》上。

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DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰,调节着许多生物学过程。研究这种修饰的金标准方法是亚硫酸氢盐测序。为此,多家公司推出了亚硫酸氢盐转化试剂盒。这些试剂盒在转化效率上表现不错,但DNA损失和DNA片段化等问题仍让人苦恼。

针对这些问题,比利时根特大学的研究人员近日评估了12种亚硫酸氢盐试剂盒的表现。他们综合利用凝胶电泳、定量PCR、数字PCR以及新一代测序(NGS)等方法,寻找这些试剂盒之间的差异。评估结果于上周发表在《PLOS One》上。

亚硫酸氢盐处理的方法于1992年最早提出,到现在仍然是分析DNA甲基化的金标准。它的原理大家都清楚,亚硫酸氢盐处理使未甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶(mC)保持不变,之后可通过测序分析甲基化图谱。尽管广泛使用,但这种方法也有缺点。苛刻的反应条件会造成DNA片段化和降解。

在这项研究中,研究人员评估了市场上12种亚硫酸氢盐试剂盒的表现,重点关注DNA片段化。这些试剂盒包括Zymo Research的EZ Gold和EZ Lightning,QIAGEN的Epitect和Epitect Fast,默克密理博的CpGenome、Epigentek的Bisulflash和Bisulflash Easy等。

研究人员利用光谱测定(Qubit 2.0荧光计)和dPCR来确定DNA产量,利用凝胶电泳、qPCR和dPCR来评估DNA降解,并利用新一代测序来确定转化效率。他们发现这些试剂盒存在明显的差异。

以DNA片段化为例,凝胶电泳分析检测到Epitect和CpGenome试剂盒存在较大片段,说明它们的片段化程度最低。利用qPCR对88 bp至476 bp的片段进行扩增时,发现Epitect和CpGenome试剂盒的Cq值最小。同样地,dPCR通过绝对定量,发现这两款试剂盒中的DNA浓度最高。由此可见,这两款试剂盒造成的DNA片段化最少。

在DNA回收率方面,EZ Gold试剂盒表现最佳,而同一家公司的EZ Lightning试剂盒却排名第六。研究人员认为,既然这两种试剂盒采用了相同的DNA脱璜和DNA纯化,那么影响DNA回收率的可能是转化缓冲液和转化条件。

至于哪个试剂盒是最佳的亚硫酸氢盐转化试剂盒,研究人员认为这要取决于具体实验。对于DNA长片段的甲基化研究,Epitect试剂盒是理想之选,因为它造成的片段化最少。在分析短片段时,则要考虑其他因素:如果DNA数量有限,需要高回收率,则EZ Gold似乎是更好的选择。(生物通 薄荷)

原文检索

Kint S, De Spiegelaere W, De Kesel J, Vandekerckhove L, Van Criekinge W (2018) Evaluation of bisulfite kits for DNA methylation profiling in terms of DNA fragmentation and DNA recovery using digital PCR. PLoS ONE 13(6): e0199091. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199091

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