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与Sanger测序齐名的另一种测序技术为何消失?

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年07月12日 来源:生物通

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  当DNA测序技术在20世纪70年代闪亮登场时,有两种技术引起了广泛关注。不过,若干年后,大家只熟悉Sanger测序。那么,另一种技术究竟发生了什么?

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在20世纪70年代中期,两种直接测序DNA的技术被开发出来,其中一种是广为人知且沿用至今的Sanger双脱氧链终止方法,另一种是现在几乎被人遗忘的化学测序方法,Maxam–Gilbert测序。

这种测序方法是由美国哈佛大学的Walter Gilbert和他的学生Allan Maxam开发的。1980年,Frederik Sanger和Walter Gilbert因“在测定核酸碱基序列上的突出贡献”而分享了当年的诺贝尔化学奖。

事实上,Maxam–Gilbert方法一开始比Sanger测序更为流行,因为它可以测序双链DNA,而Sanger技术需要克隆后产生单链DNA。不过,随着新技术的出现,Maxam–Gilbert方法逐渐消失。

如何诞生

Gilbert曾经是一名物理学家,当他遇见James Watson后,开始对分子生物学感兴趣。Gilbert知道DNA序列携带了生命的密码,是从父母传递给后代,但在当时,人们根本不知道DNA序列是什么。

在60年代,Gilbert和他的同事完成了分离lac阻遏物的研究,这种蛋白质与DNA的特定区域结合。然后,他们尝试分离这段DNA区域。当蛋白与特定区域结合时,他们利用DNase酶来消化DNA的其他部分。lac阻遏物的结合保护了这一区域,使得他们成功分离。

不过,他们发现DNA测序方法的开发既困难,又费力。他们试图将DNA片段复制到RNA中,并设法通过酶分解以及电泳分离来测定RNA序列。这种方法似乎有效,不过极其慢,花了两年才确定24个DNA碱基,大约每个月一个碱基。

之后,一名俄罗斯人拜访了Gilbert,尝试说服他做一项实验:通过化学试剂来修饰与lac阻遏物结合的DNA。如果他们能够将DNA上的鸟嘌呤(G)甲基化,那么就有可能区分每个碱基。Gilbert认为这是一项艰巨的任务,前景渺茫。不过,半年后俄罗斯人又来了。

他们尝试用限制性内切酶来切割DNA,获得长度大约在100 bp的片段,然后在DNA片段的一端加上放射性标记。G的甲基化会影响它,使得DNA在这个点断裂。

“这无疑是一种测序方法。唯一的问题是你是否能够通过观察A和G来测序DNA?”Gilbert评论道。于是,他们又开始寻找化学试剂,来选择性地处理C或T。

Maxam–Gilbert方法最终于1975/76年诞生,那篇详细介绍它的文章于1977年发表在《美国科学院院刊》(PNAS)上。Gilbert的学生最终成功测序了长达5000 bp的质粒。

如何测序

Maxam–Gilbert测序方法的第一步是将选定的DNA片段变性成为单链,然后用放射性的磷32标记,通常在5’端。第二步是切割DNA链,利用哌啶和硫酸二甲酯来选择性攻击嘌呤碱基,利用联氨(肼)来选择性攻击嘧啶碱基。

通过使用不同的试剂组合,你可以选择性地切割DNA,让它在指定的地方断裂,比如C;C+G;G或G+A。将DNA样品上样到带有不同试剂的试管中,将产生不同的DNA片段。之后将这些片段上样到聚丙烯酰胺凝胶中,通过电泳区分DNA片段的大小。

在读取序列时,你需要从凝胶底部的小片段开始,然后依次推进。如果条带出现在G反应和G+A反应的泳道,那么这个碱基就是G。类似地,如果条带仅仅出现在G+A的泳道,那么它就是A。这个过程也同样适用于C和C+G泳道。

如何消失

尽管Maxam–Gilbert方法一度成为最流行的测序方法,但最终还是消失了,这其中有几个原因。首先,它相当耗时。整个过程涉及到多个步骤,它们本身都很耗时。其次,步骤越多意味着犯错的机会越大。如果出现错误,结果无法重复,那么错误排查也是一个大问题,需要花不少时间。

这种方法需要花几天的时间才能确认200-300个碱基,因此在规模放大时也遇到困难。考虑到人类基因组包含30亿对碱基,Maxam–Gilbert方法的消失也就不难理解了。就健康和安全而言,它也不是最佳的选择。需要用到大量的放射性物质,以及联氨这种已知的神经毒素。

相对而言,Sanger测序要简单一些。同时,其他技术也在快速发展。这一切使得Maxam–Gilbert化学测序方法最终失去了吸引力。到了20世纪80年代,Sanger测序成为人们的新宠。

Gilbert在开发测序方法时并没有预料到DNA测序终有一天将被用于全基因组的测序,直到1985年他应邀参加一个会议。

“我参加了那次会议,认为这是我听到的最愚蠢的事情。这比我们现在测序的东西要大得多。不过在会议上,考虑到技术所处的位置,我意识到还是有可能测序基因组的,然后我成了基因组测序理念的倡导者,”Gilbert说。

“在我开始测序时,每个月测一个碱基,如今是一个下午测数十亿个碱基。作为整个过程的参与者,我也觉得这不可思议。”

正如科学研究的各个分支一样,理论和技术的进化都是不可避免的。现在流行的技术,也许十年后已无人提及。不过,对于这种经典方法的消失,大家难免还是有一些失落和不舍。

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