宏基因组学：照亮整个微生物世界

如今，最有前途的新兴组学领域是宏基因组学。这个学科是对土壤、粪便和水等样本中的整个微生物群落进行研究。面对庞大而复杂的微生物群落，研究人员有哪些对策，又面临哪些挑战？

最近三十年，组学研究一直是热点。最早火起来的是基因组学，然后是蛋白质组学。如今，最有前途的新兴组学领域是宏基因组学（metagenomics）。这个学科是对土壤、粪便和水等样本中的整个微生物群落进行研究。

通过这种研究，人们有望为多个领域提供新颖的研究思路，比如对付抗生素耐药性。早前，我国学者曾经开展一项研究，对17个主要城市的32个污水处理厂的样本开展宏基因组分析，发现了381个在各大城市都普遍存在的抗生素耐药基因。这表明可以通过监控污水系统来加强抗生素的管理工作。

当然，宏基因组学十分复杂。与人体或动植物的基因组或蛋白质组不同，微生物群落庞大且复杂，因此不能全部测序，只能抽样。据宏基因组学先驱、加州大学圣地亚哥分校的Rob Knight教授介绍，地球上的微生物超过10的30次方，这个数字比宇宙中已知恒星的数量还要高九个数量级！

样本采集

“这个领域的主要挑战之一是样本采集和记录这一整套过程的标准化，”Synthetic Genomics的生物信息学副总裁Toby Richardson说。“举个例子，人体的典型样本是粪便。那么，什么时候取样？如何从取样地点转移到分析地点？”

宏基因组学领域的专家、美国马里兰大学的著名教授Rita Colwell也同意这个观点。“在宏基因组学研究中，人们往往忘记了需要有统计学意义的样本。只有一个样本，就得出重要结论，这是相当危险的。以水来说吧。你是过滤一毫升、十升、一百升，还是一千升？”

DNA/RNA分离

至于DNA分离的标准化，目前也存在挑战。“每个样本都是独一无二的。土壤和粪便样本在处理方法上就有很大差异，你必须尝试不同的试剂盒，才能找出最有效的提取方法，”Richardson说。

德国的Machery-Nagel公司就开发出一些专门的RNA分离试剂盒。“我们为环境样本而开发的试剂盒包含洗涤液，能够冲走腐殖酸，”该公司的产品经理Andreas Hecker谈道。“我们的粪便试剂盒还包含抑制剂去除柱，将裂解液加在上面并离心，它就能去除抑制成分，还能过滤未裂解的组分。这个步骤只需要一分钟。”

样本匀浆也使得土壤和粪便样本的制备变得复杂，因为它们含有大量难以破碎的组织。Macherey-Nagel的大多数环境试剂盒都带有NucleoSpin Bead Tube。这个2 mL的管中含有玻璃珠、陶瓷珠或金刚砂，或者是它们的混合物，能够机械破碎各种样本。Hecker指出，“玻璃珠适用于细菌，陶瓷珠适合土壤和粪便样本，而植物材料最好用金刚砂。”

在样本匀浆之后，最常见的分析方法就是扩增和分析16S核糖体RNA（rRNA）基因。“16S rRNA基因在细菌中高度保守，通过它来寻找样本中存在哪些物种是一个不错的选择，”Richardson说。

“到目前为止，我敢说已发表论文中高达80-90%的宏基因组数据都使用了16S。不过这存在某些固有的偏倚。每个物种可能有多个16S拷贝，因此除非对数据进行均一化处理，否则难以进行定量分析，”他说。

新一代测序

专家认为，16S分析也许会在某一时刻被新一代测序所取代。Rita Colwell教授表示：“最初，大多数人都对16S的结果感到满意，但现在NGS的结果更激动人心。不过，我们正处在起步阶段，一些标准化的东西必须被开发出来。这将加速FDA批准新一代测序作为一种工具。”

目前，有许多开源工具可用于高通量16S RNA测序研究的分析。MG-RAST服务器提供了序列片段的注释、系统发育分类、样本的功能分类，以及多个宏基因组之间的比较。 Knight博士的QIIME让用户可以将Illumina或其他供应商平台上生成的原始测序数据转换成出版级别的图形和统计数据。

Richardson认为，测序和组装都很便宜，但注释将成为瓶颈。他表示，Synthetic Genomics拥有的技术将加速这一过程。这家公司最近组装了一个高达47 Gb的微生物组数据集，比目前发表的数据都要大。以往，注释过程可能需要几个星期。现在有了深度学习和人工智能，他们能够在一小时内完成注释，只需几百美元。

现场工作

当然，宏基因组学研究还需要一些可以从实验室搬到现场的工具。CosmosID 公司的副总裁Nur Hasan 表示：“我们需要一些用户友好的工具，让那些没有接受过培训的普通生物学家也能开展大规模分析。比如，当疫情爆发时，我们需要快速确定病原体是来自食物、水还是医院传播。”

CosmosID正在开发此类解决方案。“你需要快速分型，但眼下这项工作太费时，除非你聘请一名生物信息学家，并拥有相关设施。我们正在建立一个宏基因组数据库，并开发经过验证的算法，为快速的流行病学分型提供简便的工具，”Hasan说。

根据Colwell博士的预测，在未来五年内，手持式的宏基因组测序设备有望在医院等地使用，让即时诊断成为现实。“Illumina无疑也在为此而努力。回想40、50年前，我开发出第一个计算机程序来分析微生物分类数据，那是多么乏味的事情。现在，我们只需要一台笔记本电脑就搞定了。未来是值得期待的，”她说。

（作者：Gina Shaw / 生物通编译）