PASEF技术带来蛋白组学研究的新速度和新深度

为解析疾病进展的分子机制并发现新的治疗方法，科学家必须弄清楚蛋白质组复杂的动态变化。基于高分辨率质谱（MS）的蛋白质组学技术已发展成为一种高效工具，可用于分析数以千计的蛋白质。尤其是通过将新型分离技术与高效快速的扫描方法相整合，已经使得研究人员能够更深入地探索蛋白质组。

作者： Bruker Daltonics Inc. 蛋白质组学副总裁Gary Kruppa；及Bruker Daltonik GmbH 蛋白质组学全球市场经理Scarlet Koch

鉴定并精确定量多肽和蛋白质以了解其生物学功能的能力，很大程度上取决于分析技术的进步，如质谱（MS）技术。目前市场上质谱仪的灵敏度和速度的提高，促进了质谱仪在蛋白质表达模式检测中的重现性和速度，并将最终推动特定环境、生理或疾病条件下的蛋白质特性的鉴定与表征。尤其是离子传输效率的提高、以及仪器识别并量化离子信号的速度的提高，正在推动众多蛋白质组学应用的发展。

基于MS的蛋白质组学研究方法对于大规模翻译后修饰（PTMs）分析、蛋白质-蛋白质相互作用的研究以及临床生物标志物的鉴定尤其重要。临床蛋白质组学研究有助于一系列疾病的诊断与治疗，并将随着MS应用领域的扩展而不断发展。对复杂临床样本如组织、血液或血浆等的深入分析，需要高特异性、高灵敏度和高通量的分析方法。四极杆飞行时间（QTOF）质谱仪能够提供具有高重现性、深度覆盖率的蛋白质组学数据，由于其高采集速率，特别适合于蛋白质组的快速检测。本文着重介绍了QTOF MS与捕集离子光淌度谱（TIMS）的集成，以及一种革命性的新采集方法——同步累积连续碎裂（PASEF）的应用，显著提高了蛋白质组分析的速度、灵敏度和稳定性，使科学家有可能发现更多低丰度、具有重大生物学意义的蛋白质，并能在研究中对其进行验证。

加速鸟枪法蛋白质组学

鸟枪法蛋白质组学（也称为发现蛋白质组学）是主要的Bottom-up技术，它使用数据依赖性采集（DDA）进行无偏蛋白质组覆盖。在DDA模式下，质谱仪每隔几秒钟扫描整个质量范围（通常为300～1650 m/z）的肽段以获得一级谱图（MS1），然后将MS1谱图中强度最高的多个肽段依次隔离，并采用四极杆或线性离子阱将母离子碎裂成子离子，采用串联质谱（MS/MS, MS2）进行肽段鉴定。

在使用DDA时，研究者无需预先知道蛋白质的种类。此外，快速的谱图采集和尽可能多地碎裂肽段的能力，这使得DDA非常适合于发现研究。然而，DDA方法的缺点在于它依赖于质谱仪的测序速度，因此，只有一部分高丰度的洗脱肽可以被碎片化。MS技术的发展、TIMS与PASEF相结合的采集方法的采用，极大地提高了鸟枪法蛋白组学的测序速度，有助于大规模的蛋白质鉴定和定量，以及蛋白质生物标志物的发现。

PASEF是一种全新的方法，使多个母离子被平行地存储在捕集离子淌度管中，然后可以接着进行连续碎裂。它可实现每秒数百个MS/MS检测，具有高出传统技术数倍的速度和灵敏度[1]，并且提高了DDA检测速度。采用PASEF技术， 70%的母离子可以被选定并利用MS/MS进行鉴定[2]。

鸟枪法蛋白组学数据处理

基于MS的蛋白质组学研究会产生庞大的数据集，使得对这些数据的分析具有历史性的挑战。数据分析包括离子信号的检测和处理、多肽的识别、蛋白质鉴定和定量，MaxQuant作为一款可以免费获得的软件，已可以应对这些挑战。timsTOF Pro采用的一种完全开放的数据格式（Bruker Daltonics），使研究人员在进行鸟枪法蛋白质组学分析时可以开发软件直接处理原始数据。PEAKS Studio是另一个支持MS数据分析的软件包，也能够处理来自timsTOF Pro的数据，它具有独特的从头测序算法，被集成到传统数据库搜索中，以确保对原始数据的完整解析。这一解决方案应对PASEF数据的复杂性，通过多肽/蛋白质的鉴定和定量、肽段定位和PTM表征，推进蛋白质组学研究。

PASEF的应用

测序速度和灵敏度的增加，以及将PASEF方法应用于TIMS-QTOF MS提供的额外分离维度，已被证明有效缓解了DDA鸟枪法蛋白质组学所产生的一些挑战。

马克斯-普朗克生物化学研究所的一个小组已经展示了TIMS-QTOF MS采用PASEF技术进行鸟枪法蛋白质组学研究的应用。其最新研究揭示了采用不同的母离子选择方案进行蛋白组学研究的效果，获得了对每秒钟超高100个以上碎裂事件进行最佳分配的方案[1]。该小组的研究结果还突出显示了timsTOF Pro以最小样本量实现高灵敏度的特点。人宫颈癌细胞（HeLa）蛋白经LysC和胰蛋白酶酶解成复杂的多肽混合物，经LC分离和timsTOF Pro鉴定。为了在每个采集循环选择到尽可能多的母离子并成功鉴定，专门开发了一种算法。图1显示了PASEF实时进行母离子选择的三个维度，即母离子的m/z、信号强度和离子淌度。该算法从100 ms的TIMS扫描中选择了50个独特的母离子，并在随后的PASEF扫描中进行碎裂。

图1：PASEF在三个维度中的实时选择母离子。采用热图可视化的呈现了在LC-TIMS-MS 分析HeLa酶解物的单个时间点上，离子淌度有效分辨肽段离子的能力。连接线显示了被选择在随后TIMS-PASEF扫描中碎裂的所有母离子的m/z和淌度信息（颜色编码）。

在低样本量下对仪器检测速度和灵敏度的进一步实验表明，在标准的120分钟LC分析中，很容易获得超过800000个二级谱国。使用PASEF方法，在30分钟LC运行中，可从仅10 ng HeLa细胞蛋白酶解液中鉴定出超过2900种蛋白质，这显示出其优越的灵敏度（图2）[1]。

图2：快速、灵敏的HeLa细胞蛋白质组检测。（a）60分钟梯度、三种不同样本量的总离子流图。（b）60分钟梯度的三次重复实验鉴定和定量（CV< 20%）的蛋白质的平均数目。（c）30分钟梯度、三种不进样量的总离子流图。（d）30分钟梯度的三次重复实验鉴定和定量（CV<20%）的蛋白质的平均数目。（e）5.6分钟梯度、50 ng HeLa细胞酶解物的总离子流图。（f）5.6分钟梯度、十次重复实验中鉴定的蛋白质数目。

如果没有使用PASEF方法，timsTOF采用超过100 Hz的高频采集通常会带来很短的离子采集时间，因此，谱图的质量较差。然而，采用PASEF方法，离子通过捕集离子淌度谱（TIMS）分析器时在时间和空间上进行聚焦，实现TOF仪器的快速全扫描，同时保持非常高的灵敏度，从而能够在单次运行中以最小样本量和高定量准确度鉴定数千个蛋白质。

基于MS的临床蛋白质组学

在临床应用中，许多类型的患者样本数量非常有限，这对目前大多数蛋白质鉴定技术带来了挑战。PASEF技术赋予鸟枪法蛋白质组学以更高的速度和灵敏度，使之非常适合于微量样本的分析。因为候选的蛋白质生物标志物可能存在于血浆蛋白浓度范围的低丰度区[2]，PASEF赋予TIMS-QTOF MS的高灵敏度可以推动生物标志物发现的研究。

临床蛋白质组学的展望

基于MS的蛋白质组学研究提供了大量与分子通路的构成、调节和功能相关的重要信息，促进对复杂生物过程的深入理解。新的技术创新，如在蛋白分析方法，TIMS-QTOF MS采用的PASEF方法，将通过对复杂样品中数千甚至上万种蛋白质的精确鉴定和定量，不断发挥其生物学和医学上的积极影响。

个性化医学是一个快速发展的领域，由于并非所有疾病状态都具有遗传标志物，所以基于MS的蛋白质组学的应用推动其发展。比如MS在临床蛋白质组学中的使用可以促进靶向治疗的应用，基于MS的蛋白质组学的疾病相关生物标志物的检测也可以在未来获得进一步发展，特别是采用PASEF技术的TIMS-QTOF MS在临床蛋白组学中的应用。

参考文献

1. Florian Meier, Andreas-David Brunner, Scarlet Koch, Heiner Koch, Markus Lubeck, Michael Krause, Niels Goedecke, Jens Decker, Thomas Kosinski, Melvin A Park, Nicolai Bache, Ole Hoerning, Juergen Cox, Oliver Raether, Matthias Mann (2018) Online parallel accumulation − serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer, https://doi.org/10.1101/336743
2. Florian Meier, Scarlet Beck, Niklas Grassl, Markus Lubeck, Melvin A. Park, Oliver Raether and Matthias Mann (2015) Parallel Accumulation−Serial Fragmentation (PASEF): Multiplying Sequencing Speed and Sensitivity by Synchronized Scans in a
Trapped Ion Mobility Device, Journal of Proteome Research, Vol 14, pp 5378-5387.
3. Scarlet Beck (2016) Novel quadrupole time-of-flight mass spectrometry for shotgun proteomics. PhD Thesis, Ludwig-Maximilians-Universität, München.

关于作者

Gary Kruppa， Bruker Daltonics Inc.蛋白质组学副总裁。主要负责布鲁克蛋白质组学研究的创新解决方案的市场和应用开发管理。

Scarlet Koch， Bruker Daltonik GmbH蛋白质组学全球市场经理。

关于Bruker公司

50多年来，Bruker已帮助科研人员取得可提高人类生活品质的突破性发现，并开发出诸多新的应用。Bruker的高性能科研仪器和宝贵的分析解决方案，使科研人员得以在分子、细胞和微观水平上开展对生命和材料的探索。

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