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不仅是省事,蛋白预制胶带您领略条带之美[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年08月24日 来源:生物通

摘要:

  所谓,成功的实验都是相似的,不成功的实验则各有各的问题。不幸漏胶、凝胶太慢、胶孔漏样、条带不齐,这些蛋白电泳中的问题至少遇过一两个吧。其实,您还有一个选择,那就是蛋白预制胶。

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对天天与蛋白打交道的研究人员来说,蛋白电泳那就是家常便饭。据《分子克隆实验指南》统计,您至少要准备六种溶液,经历六个步骤,才能制备好凝胶。如果一切顺利的话,最快两个小时可以跑上电泳。

所谓,成功的实验都是相似的,不成功的实验则各有各的问题。不幸漏胶、凝胶太慢、胶孔漏样、条带不齐,这些问题至少遇过一两个吧。对于进度紧的人们来说,花时间做troubleshooting,在论坛中找答案,实在是一件费时又费力的事情。其实,您还有一个选择,那就是蛋白预制胶。

预制胶,顾名思义,就是厂家预先制备好的凝胶。打开包装就能用,点上样本就能跑,这实在是大大加快了实验进程,让您有更多可支配的时间。同时,也让您远离繁琐的操作和有毒的试剂,不再为漏胶等问题而烦恼。

即使您是实验达人,每次灌胶都是又快又好,预制胶还是可以带给您更佳的体验:预制胶的成分更均一,批间差异小,最终的数据将体现出更高的一致性和重复性;同时,与手动灌胶相比,预制胶分离的蛋白条带更加锐利,分辨率也更高,能够获得更漂亮的电泳结果。在发表文章时,这些笔直而清晰的条带无疑将成为加分项。此外,预制胶的保质期也更长。自制的凝胶大约只能保存一周,而预制胶能保存数个月,甚至一年。

也许您想说,我们实验室研究的蛋白有很多种,有人关注2.5 kDa的蛋白,有人关注250 kDa的蛋白,电泳时需要相应调整分离胶的浓度,而预制胶只有固定规格,怎么满足我们不同人的需求呢?其实,预制胶也有很多种,比如赛默飞世尔科技就提供多达181种预制胶产品,轻松满足各方面的需求。

变性分离

Invitrogen NuPAGE Bis-Tris预制胶在全球的生物和制药公司以及科研院所广受欢迎。上市20余年,已有超过2万篇文献引用,足以证明科学家对它的信赖与喜爱。它采用创新的Bis-Tris体系,与传统的Laemmli Tris-甘氨酸系统的碱性工作环境不同,Bis-Tris凝胶在电泳过程中提供了中性 (pH 7.0) 环境,可保护蛋白质的本真性,最大程度减少蛋白质由于外部环境引起的化学修饰和降解。不少用户反映,使用这种预制胶后的确能得到锐利而笔直的条带,不再是之前的“微笑”条带,后续的免疫印迹结果也更漂亮。此外,电泳时间也大大缩短,从过去的90分钟缩短到现在的35分钟到50分钟。

在分离不同的蛋白时,您也有许多不同的选择。NuPAGE Bis-Tris预制胶目前提供四种浓度(8%、10%、12%和4-12%)、两种规格(小型胶8x8 cm、中型胶8x13 cm)、两种厚度(1.0 mm和1.5 mm)以及不同孔数的多种产品可供选择。

众所周知,分离较大的蛋白质需要使用较低浓度的凝胶,而分离较小的蛋白质和肽段则需要较高浓度的凝胶。单一浓度胶常用于检测某一特定分子量范围内的蛋白质,梯度胶则可以满足同时分离高分子量与低分子量蛋白,而且条带分布得会更均匀。不过手工配制梯度胶的难度较高,品质也难以保证,而使用商业化的预制胶则能省心不少。

为了获得更好的蛋白分离效果,需要根据目的蛋白大小搭配相应的电泳缓冲液。NuPAGE MES SDS电泳缓冲液适用于分离小分子量的蛋白,而NuPAGE MOPS SDS电泳缓冲液则适合分离中等至大分子量的蛋白。如果蛋白容易氧化,还可以在电泳缓冲液中加入NuPAGE抗氧化剂,从而在电泳过程中维持蛋白的还原状态。

如果您特别钟情于研究大蛋白或小蛋白,那么还有专门的凝胶可供选择。在分离分子量高达500 kDa的蛋白时,可以使用NuPAGE Tris-乙酸预制胶。在分离分子量低于20kDa的蛋白或肽段,尤其是需要同时分离多个小分子量蛋白时,则可以选择Novex™ Tricine预制胶,以获得更高的分辨率。

非变性分离

如今,越来越多的研究人员开始使用非变性凝胶。与变性凝胶相比,不含SDS的非变性凝胶体系在分离蛋白的同时,能够保留其天然的结构,从而可用于蛋白质之间相互作用的研究,以及蛋白质复合物的分离和分析。

赛默飞世尔科技也为这些研究人员提供了NativePAGE Bis-Tris非变性蛋白预制胶。它是基于Blue-Native PAGE的原理,让考马斯亮蓝G-250附着在蛋白上使其带有负电荷,同时保持蛋白质的天然状态,不会使其变性。在上样前将G-250添加于含有非离子型表面活性剂的蛋白样本中,可以让蛋白带上负电荷;同时G-250也会加于阴极缓冲液中为凝胶提供持续的G-250供给,传统的非变性电泳大多采用Tris-甘氨酸系统,其工作pH较高(9.3-9.5),会对在高pH条件下敏感的蛋白质带来不利影响,相比之下,NativePAGE Bis-Tris预制胶的工作pH接近中性(7.5-7.7),有助于保持蛋白质的天然结构和对高pH值敏感的蛋白质的活性。同时,由于传统的Tris-甘氨酸非变性电泳系统主要利用工作pH高于蛋白质等电点而使其带上负电荷后进行电泳,因此不适用于等电点高于电泳工作pH的蛋白质。而NativePAGE利用考马斯亮蓝G-250使蛋白质在非变性条件下带负电,并在近中性工作pH下进行电泳,因此无需再考虑蛋白的等电点造成的限制。

此外,传统的非变性Tris-甘氨酸凝胶电泳不能兼容需要使用非离子去垢剂进行增溶的蛋白样品,因为随着蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移,会将非离子型去垢剂遗留在后方;当缺少非离子洗涤剂时,蛋白质会聚集并在泳道顶部形成带状条纹。(下图A)。在使用NativePAGE Bis-Tris预制胶时,考马斯亮蓝G-250可显著减少蛋白质聚集,从而达到Tris-甘氨酸凝胶无法实现的膜蛋白质复合物分辨率(下图B)。图中呈浅绿色的条带是含有叶绿素的膜蛋白质复合物。

A.非变性Tris-甘氨酸预制胶  B.NativePAGE™ 4-16% 非变性预制胶

利用NativePAGE非变性凝胶电泳可以对天然蛋白分子进行纯度测定和分子量大小估算,以及对膜蛋白或可溶性蛋白质复合物、蛋白质相互作用、酶活性等进行分析。此外,还可以利用Native/SDS-PAGE二维电泳对蛋白质复合物亚基进行分析:第一维使用NativePAGE凝胶,第二维使用变性SDS-PAGE凝胶。这种方法很好地替代了传统的二维电泳(IEF/SDS-PAGE)。目前,赛默飞世尔科技提供两种浓度的NativePAGE Bis-Tris预制胶:3-12%和4-16%,适用于15-1,0000 kDa蛋白的分离。凝胶厚度为常用的1.0 mm,孔数可选10孔和15孔。不过,需要注意的是,这种预制胶的保质期为6个月,如果囤货的话要留心效期。

结语

手灌胶的表面成本看起来较低,但最终性能成本却可能恰恰相反。因为如果每次实验的结果不一致或不理想,那么实验就必然要重复,这其中所耗费的试剂、时间和人力都不能忽略。尤其是那些对上游实验要求较高的应用,比如质谱分析和蛋白测序,若因为电泳没做好而重来一回,那损失可不是小数目。更何况,有些珍贵样本可是“限量版”,失去就不再来。

随着杂志审稿的要求越来越严格,手灌胶胶已经未必能满足发表的要求。NuPAGE预制胶的质控标准在业内来说是最严格的,因而批间一致性更好,可提升实验的重复性,这也是众多跨国医药研发中心纷纷选择NuPAGE预制胶的原因。它不仅将您从枯燥的实验中解救出来,更让您对实验结果充满信心。

现在,您完全可以跟繁琐的灌胶说拜拜,跟有毒的试剂说再见;您还可以空出更多的时间专注于科研上的思考和前进,或者您也可以收获更多的时间筹划一场说走就走的假期;至少,您还可以准时下班,准点吃饭。(生物通 余亮)

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