访谈：做单细胞测序，你真的准备好了吗？听听大咖怎么说

近几年，单细胞测序是比较热门的研究方向。但是，理想很丰满，现实却很骨感。要做好单细胞测序，还要面临单细胞获取困难、起始量超低、人工操作偏差大的问题。那么如何妥善的解决这些问题，做好单细胞测序呢？为此，生物通特意采访了Takara Bio China NGS团队的产品经理，就客户感兴趣的问题进行探讨。

　　

小贴士：

Takara Bio是一家集试剂、耗材、仪器和服务为一体的全球知名公司，秉承开发和提供高品质的创新技术和服务的使命，旨在帮助研究人员探索在基因检测、调控和功能等领域的有关问题。旗下的Clontech品牌拥有单细胞RNA-Seq文库构建的核心专利——SMART技术，被认为是单细胞测序行业的翘楚，由此发展出的单细胞全基因组扩增技术、高通量单细胞捕获分选等技术亦在业内享有盛名。

生物通：您好，很高兴您能接受生物通的采访，一起探讨单细胞测序技术。我们知道对于群体细胞测序，科研人员获得想要分析的样品可能相对比较容易，但是单个细胞，想想就觉得很难获得，所以想请问贵团队，目前业内有什么比较好的方法呢？

Takara：首先谢谢您的采访。确实相较于群体细胞测序，单细胞样品的分离、获取难度会大幅度增加。虽然很难，但是面对如此前沿的领域，科研人员“前仆后继”开发出了多种方法获得单细胞。最早出现的应该是“显微镜下人工挑选”，比较费事但不需要特殊仪器；激光显微切割仪、流式细胞仪也常见于各大研究所的仪器中心，但是这些技术对细胞活率有一定影响，通量也不高。 随着人们科研需求的逐渐增长，已不满足于传统的分离技术，因此市面上出现了基于微流体、Droplet、纳米孔芯片技术的高通量方法，一次能分选出至少上千单细胞。其中我们判断基于纳米孔芯片技术且带光学组件的系统，以其能高通量挑选出“活的单细胞”、兼容各种尺寸细胞，或会是未来更看好的方向。

生物通：单细胞转录组测序是大家尤为关注的研究。您能否介绍一下，在获得单细胞后，进行单细胞RNA-Seq的研究策略？

Takara：当然可以。从最早的汤富酬老师的单细胞RNA测序技术报道以来，单细胞测序的技术不断涌现，有多种方法可以选择。比如CEL-seq以及升级的CEL-Seq2技术，利用带有唯一条形码的引物对每个细胞进行逆转录，因为采用线性扩增，所以错误率比较低。但需要注意的是CEL-seq仅能检测转录本的3‘ 端。相比而言，Clontech的SMART-Seq技术，拥有独特的末端转移机制和模板转换功能，能够保证捕获的是全长的mRNA；之后，改良的SMART-Seq2则进一步减少了RNA丢失率，同时再现性也有所提高。

生物通：好的，那我们再聊一聊单细胞全基因组扩增技术。它的瓶颈和技术难点又主要是什么呢？

Takara：每个细胞内，一般只有一到两个DNA拷贝，远没有达到高通量测序仪器的最低上样要求。因此需要先对单细胞内的DNA进行全基因组扩增。而且必须尽可能避免样本的损失和污染，尽可能保证扩增的覆盖度、均一性等，这都是极其困难的，所以对单细胞全基因组扩增的相关技术要求是比较高的。

生物通：确实，要对DNA含量如此低的单细胞进行的全基因组研究是很难想象的。那进行单细胞基因组研究，您有什么比较好的技术推荐吗？

Takara：在单细胞全基因组测序技术诞生以来，单细胞全基因组扩增经历了多次变革，目前主要有PicoPLEX、DOP-PCR、MDA和MALBAC等几种方法，客户可以根据自身的研究需求选择合适的技术。比如胚胎植入前遗传诊断（即PGD）是辅助生殖常用的技术，需要对极稀少而珍贵的胚胎细胞进行单细胞层面的基因组分析，有效的排除遗传风险，孕育健康的宝宝。如果想进行这个方面的研究，那么在拷贝数边和和染色体异倍性分析上具有优势，且操作简便的Clontech的PicoPLEX技术，可以说是一个不错的选择。

生物通：我们在做常规样品基因差异表达等分析时，都很难判断结果的差异究竟是样品本身基因表达的不同，还是由于操作偏差所造成的，何况更为精细的单细胞层面的分析。对于减少偏差，贵团队有没有什么好的建议？

Takara：如您所说，不管是初学者，还是技能非常熟练的实验人员，都无法避免实验过程中产生偏差，只是偏差大和小的问题。特别是像单细胞测序文库的构建，步骤繁琐且复杂，反应体系、样本都很微量，一不注意样品损失了，或者体系构建错误了，实验就会引入很大的偏差。为了减少偏差，实验人员在自身实验素质提升的基础上，可以选择更为精确的移液设备，如量程合适的移液枪，或者在处理多个样品时，使用8通道排枪替代单通道移液枪。也可以选择更为简便操作的文库构建试剂盒，如单管操作、一步法完成、过程中无需纯化的产品，尽量减少样品的损失。当然，现在也流行使用自动化工作站，替代人工完成文库构建过程中移液、孵育、纯化等操作，同时对多个样品进行文库构建，大为降低手动操作时间，相对而言是目前的最佳解决方案。

生物通：非常感谢您与我们分享了这么多单细胞测序。相较于群体测序，单细胞测序是一种相对高精尖的研究方法。很多客户想知道Takara公司有什么好的技术和方法，贵团队是否能帮忙推荐，以便大家更好的进行单细胞测序研究？

Takara：是的，单细胞测序对技术要求比较高，每个环节都可能决定实验的成败。因此为了尽可能使大家避开“雷区”，轻松得到准确的单细胞分析结果，我们团队特别策划了一个单细胞测序专题：“手把手”告诉大家如何获得想要的单细胞，如何制备高质量的单细胞转录组、全基因组、免疫组库的测序文库，如何减少实验偏差。接下来会通过贵平台向更多的客户朋友展示，也希望Takara的单细胞测序解决方案能帮助更多的客户更好的开启单细胞测序研究之旅！

生物通：非常感谢Takara这么用心的准备！最后也再次感谢您接受我们的采访，期待下一次的见面！

Takara：好的，谢谢，下次见！