利用FFPE样本做ChIP的新型简便实验流程[新品推荐]

【字体: 时间:2018年08月06日 来源:基因有限公司

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  近日,Covaris联合法国勃艮第特许大学的学者将Covaris truXTRAC FFPE提取和truChIP染色质剪切两个试剂盒工作流程整合并对其评估,设计出一个简单、快速、重复性高、可规模化的利用FFPE样本提取染色质后下游进行ChIP实验方案。

研究癌症表观基因组学对于区分原发性和次生性肿瘤的病例机理非常重要。这些深度信息能帮助研究人员改善肿瘤的分层和分类,继而改善治疗方法的选择。FFPE样本能够保存各种实体瘤不同阶段的组织及其亚型,这些组织对后续做回顾性分子水平的研究具有巨大的研究应用潜力,但是FFPE保存过程却给下游的分析应用,比如高通量测序,带来技术上的挑战,而利用FFPE样本做ChIP实验更是难上加难。

为了能利用现有FFPE这一丰富的病理样本库对染色质和转录因子进行研究,有必要开发出一种快速且重复性高的方法,使得利用FFPE样本进行下游ChIP实验成为可能。2016年Cejas1和同事成功利用石蜡包埋组织进行组蛋白ChIP实验,虽然建立了方法但是整个石蜡去除和组织再水化过程非常耗时和繁琐,难度较高。那么有没有可能建立快速高效可重复的FFPE样本做ChIP实验,使我们能够利用现有的FFPE样本库进行疾病表观遗传学变化的研究呢?

近日,Covaris联合法国勃艮第特许大学(Univ. Bourgogne Franche-Comté)的学者将Covaris truXTRAC FFPE提取和truChIP染色质剪切两个试剂盒工作流程整合并对其评估,设计出一个简单、快速、重复性高、可规模化的利用FFPE样本提取染色质后下游进行ChIP实验方案。Covaris基于其专利AFA(聚焦超声技术)开发的truXTRAC FFPE提取试剂盒,方便科研人员从FFPE样本中提取高质量的DNA和RNA,且提取的量能够满足二代测序需要2,3。同时,Covaris的truChIP染色质剪切试剂盒也被认为是从哺乳动物细胞和新鲜组织中制备染色质的金标准。二者结合,成功开发出了一个新型快速高效FFPE样本ChIP实验解决方案。

借助聚焦超声技术,使用Covaris truXTRAC FFPE试剂盒能够从FFPE样本中提取高质量的DNA,RNA和总核酸,后续用于二代测序。与传统的被动石蜡去除法(如使用有机溶剂等)相比,聚焦适应性超声技术(AFA)能够主动去除组织中石蜡,实现组织再水化和石蜡去除过程同步进行。

使用Covaris truChIP染色质试剂盒,借助AFA技术,能够从各类哺乳动物细胞和新鲜组织中高效提取染色质,且结果高度可重复。该方案能确保分离得染色质被打断至测序所需的正确大小,且同时保持蛋白质-DNA复合结构不变,准确反映体内生物学特征。

方法

实验流程

后续做免疫沉淀,解交联和DNA纯化,使用qPCR法检测ChIP效率。

结果

1. 从组织玻片上获得目标样本后,借助蛋白酶K消化,使用Covaris truXTRAC对组织进行再水化和石蜡乳化。结果发现,调整蛋白酶的使用量有助于找到一个平衡:既能获得足够量的染色质,同时也能保证染色质结构的完整,适合下游ChIP实验(图1)。因此,推荐在进行珍贵样本实验之前,进行预实验,确定蛋白酶K的合适用量。

Fig.1 确定蛋白酶k浓度与染色质产率和ip效率的最佳平衡

 

图1. A. FFPE样本去除石蜡并超声处理,提取获得染色质。取15ul跑1.2%琼脂糖电泳。

B. 使用不同浓度的蛋白酶K,从2张10ul厚度的FFPE组织切片中提取染色质(40ng/ul蛋白酶K组使用了3张切片),Qubit检测浓度。

C 和D. 使用A和B中获得的样品进行ChIP实验。染色质的量为450ng。样品在石蜡去除前,使用梯度浓度蛋白酶K预处理。两个活性基因GAPDH(C.) 和MMP9(D.)的启动子处组蛋白第3亚基第4位赖氨酸的二甲基化(H3K4me2) 富集情况被检测确定。

2. 我们首先确定了,使用80ng/ul蛋白酶K消化组织10分钟,对于从FFPE组织样本中提取染色质做组蛋白ChIP实验,是最佳条件设定。下一步我们希望确定,同样的条件设定是否适合转录因子(比如CTCF)的研究。让人惊喜的是,使用truChIP FFEP试剂盒提取FFPE样本染色质做CTCF的ChIP实验,能够获得跟使用新鲜冰冻组织做ChIP实验一样的效果(图2)。这表明,FFPE组织样本提取的染色质保持了较好的完整性。

Fig2. 用truChIP FFPE流程进行的FFPE组织CTCF Chip富集显示与新鲜冰冻组织(FFT)相当

图2. 转录因子CTCF的ChIP实验。起始材料分别为FFPE组织样本(使用truChIP FFPE实验方法),和新鲜冰冻组织(FFT)。在两组ChIP实验中,850ng的染色质被CTCF抗体或者阴性对照IgG结合沉淀下来。富集倍数以IgG对照来计算确定。与阴性对照肌红蛋白基因的外显子2区域(Myoglobin Ex2)相比,H19 印记控制区域有显著富集。

3. 下一步,我们想明确使用truChIP FFPE实验方法与已发表的方法1提取FFPE组织样本染色质做ChIP实验的对比情况(图4)。对比显示,两种方法的ChIP富集情况较接近,且不依赖于固定时间(图3)。结果表明,truChIP FFPE实验方法是合适的,为现有实验方案提供了更为简单易行的备选。

Fig.3 基于truChIP FFPE组织提取的ChIP富集可与已发表的FFT方法1效果相当

图3. A. 对福尔马林固定8、24、72小时的FFPE组织样本施以超声处理,并设置时间梯度:0、150、300、600和900秒。纯化染色质并跑琼脂糖电泳。B和C. 对照H3K4me2 ChIP试验。起始材料福尔马林固定8、24、72小时的FFPE组织样本。染色质提取方法分别为truChIP FFPE实验方法(超声15分钟)和取自Cejas等1的FIT-seq实验方法。两个活性基因GAPDH(B.) 和MMP9(C.) 的启动子处H3K4me2的富集程度被检测确定。

Fig.4 与已发表的FFT实验流程相比,truChIP FFPE简化工作流程

图4. 优化后的FFPE组织样本ChIP实验流程更加快速、简单,整个流程时间仅需要已发表方法的1/3。AFA专利技术能够实现石蜡的去除和组织再水化同时进行,因而能实现该稳定、简单易行的实验方法。

总结

在疾病的发生和发展过程中检测染色质和转录因子状况变化的主要挑战在于需要找到合适的材料。本文,我们提供了truChIP FFPE一种快速、简单的实验流程,可以用来高质量的提取FFPE组织样本中染色质,适合做组蛋白和转录因子的ChIP实验。这就使得我们能够利用现有的组织库,拓宽我们对于疾病中表观遗传学变化的理解,为治疗干预寻找新的靶点打下坚实基础。

欲了解和获取Covaris truChIP FFPE 的详细实验流程protocol请点击下方:

索取Covaris truChIP FFPE 详细实验protocol

参考文献:

1. Cejas P, Li L, O'neill NK, et al. Chromatin immunoprecipitation f rom fixed clinical tissues reveals tumor-specific enhancer profiles. Nat Med. 2016;22(6):685-91. DOI: 10.1038/nm.4085

2. Robbe P, Popitsch N, Knight SJL, et al. Clinical whole- genome sequencing from routine formalin-fixed, paraffin- embedded specimens: pilot study for the 100,000 Genomes Project. Genet Med. 2018; DOI: 10.1038/gim.2017.241

3. Stefani MMA, Avanzi C, Bührer-sékula S, et al. Whole genome sequencing distinguishes between relapse and reinfection in recurrent leprosy cases. PLoS Negl Trop Dis. 2017;11(6):e0005598. DOI: 10.1371/journal.pntd.0005598

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