专家指南:如何高效地分析lncRNA

【字体: 时间:2018年09月21日 来源:生物通

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  长链非编码RNA(lncRNA)参与了多个生物学进程。因此,lncRNA的表达分析有助于了解基因如何表达和调控。同时,与mRNA相比,lncRNA可以作为一种更特异的生物标志物。那么,如何高效分析lncRNA?且听Arraystar资深科学家Yanggu Shi支招。

长链非编码RNA(lncRNA)参与了多个生物学进程。因此,lncRNA的表达分析有助于了解基因如何表达和调控。同时,与mRNA相比,lncRNA可以作为一种更特异的生物标志物。那么,如何高效分析lncRNA?且听Arraystar资深科学家Yanggu Shi支招。

Shi博士认为,芯片是lncRNA表达分析的首选平台。由于lncRNA的表达丰度比mRNA低得多,因此RNA测序可能掩盖其真实表达水平。从RNA测序的短序列中重建转录本也存在一定难度,因此只有不到35%的RNA转录异构体能够正确重建。

通过采用剪接点特异性或外显子特异性的探针,Arraystar LncRNA芯片能明确可靠地检测RNA的转录水平。RNA目标是通过T7启动子驱动的线性扩增而产生的,更好地保留天然的RNA丰度,同时避免RNA测序过程中因PCR指数扩增而引入的失真。

当前挑战

Shi博士表示,利用RNA测序来分析lncRNA的表达水平存在一些挑战,其中包括NGS测序读长短,覆盖剪接点lncRNA的序列丰度低,以及处理选择性剪接时的生物信息学分析复杂。

利用现有的RNA-seq比对软件HISAT2、TopHat2以及Mapsplice2,在参考转录组的辅助下检测lncRNA转录异构体的灵敏度低于20%。在寻找新的转录异构体时,需要对测序序列进行从头组装,然而,从头组装软件在转录异构体上表现不佳,只能检测少量的lncRNA。

之前一篇发表在《Nature Biotechnology》上的文章就指出了转录本特异性分析的挑战:“选择性转录本的表达谱分析需要了解基因的所有选择性转录本,并且需要组合各个转录本的信息”,“对于全基因组范围的RNA-seq而言,这一点特别困难,因为许多转录本的少量序列存在采样噪音。”显然,人们需要一种新方法来开展转录本特异性的lncRNA研究。

基于对GENCODE转录本的分析,lncRNA的表达水平约为mRNA的十分之一。许多lncRNA在每个细胞中仅存在几个拷贝。尽管它们的丰度很低,但是lncRNA仍能有效运作。例如,一些lncRNA被拴在邻近基因上,显著改变它们的表达。

lcnRNA芯片

Arraystar LncRNA基因表达芯片在同一芯片上分析lncRNA和整组已知的mRNA。通过剪接点特异性探针或独特的外显子序列,它可靠地检测每条RNA转录本及其异构体。 Arraystar LncRNA实验方案已经过优化,可产生灵敏、可靠和准确的数据,包括芯片原始数据处理、数据质量控制、基因表达聚类和热图、差异表达的lncRNA和mRNA、lncRNA亚类、lncRNA与mRNA之间的调控关系,以及通路分析。

Arraystar LncRNA芯片依赖于那些经过全面注释和实验验证的lncRNA,而不是那些“无名的”部分降解的RNA片段。这些全长lncRNA已经过鉴定,至少有一篇Pubmed研究论文发表,因此代表了lncRNA的金标准。全面注释越来越被视为了解lncRNA生物学功能的最短途径。

Arraystar LncRNA芯片有着丰富的注释和分析,它们专门针对非编码调控lncRNA,与传统的编码mRNA分析大不相同。

案例研究

多年来,Arraystar芯片一直伴随着lncRNA的研究人员。在一篇去年发表在《Nature Cell Biology》的文章中,Arraystar LncRNA芯片帮助研究人员分析总RNA以及与脂质结合的RNA,以鉴定对三阴乳腺癌有病理学意义的lncRNA。

在这项研究中,MD安德森癌症研究中心的林爱福研究团队从三阴乳腺癌病人的组织中,鉴定到9个能与脂质结合的长链非编码RNA。其中,LINK-A的表达水平最高且最特异,被选中作为研究模型。研究表明,LINK-A在AKT激活中发挥重要作用,有望成为癌症治疗的新靶点。

早前,这个研究团队还在《Cell》杂志上发表文章,利用Arraystar LncRNA芯片发现晚期乳腺癌中lncRNA-BCAR4的差异表达,表明lncRNA在侵袭性乳腺癌进展中发挥了调控作用。

通过Arraystar lncRNA芯片筛查,研究人员发现lncRNA-BCAR4在乳腺癌病人组织中表达显著上升,并且随着肿瘤转移,上升趋势明显。通过进一步研究,他们发现BCAR4是GLI2控制的基因激活的必要条件。这是研究人员首次了解乳腺癌中lncRNA与hedgehog这一经典信号转导通路的联系。

结语

RNA转录组中的大多数是非编码的,因此lncRNA对细胞的调控机制给出了独特的观点。 不过,NGS在分析和鉴定lncRNA上缺乏足够的覆盖度、灵敏度和准确性,来阐明它们在疾病和健康上的生物学作用。

Arraystar LncRNA芯片克服了NGS的缺点,其探针能够灵敏地捕获和测定低丰度的lncRNA。因此,Shi博士认为芯片可作为研究lncRNA的首选方法。

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