专家指南：如何高效地分析lncRNA

长链非编码RNA（lncRNA）参与了多个生物学进程。因此，lncRNA的表达分析有助于了解基因如何表达和调控。同时，与mRNA相比，lncRNA可以作为一种更特异的生物标志物。那么，如何高效分析lncRNA？且听Arraystar资深科学家Yanggu Shi支招。

Shi博士认为，芯片是lncRNA表达分析的首选平台。由于lncRNA的表达丰度比mRNA低得多，因此RNA测序可能掩盖其真实表达水平。从RNA测序的短序列中重建转录本也存在一定难度，因此只有不到35％的RNA转录异构体能够正确重建。

通过采用剪接点特异性或外显子特异性的探针，Arraystar LncRNA芯片能明确可靠地检测RNA的转录水平。RNA目标是通过T7启动子驱动的线性扩增而产生的，更好地保留天然的RNA丰度，同时避免RNA测序过程中因PCR指数扩增而引入的失真。

当前挑战

Shi博士表示，利用RNA测序来分析lncRNA的表达水平存在一些挑战，其中包括NGS测序读长短，覆盖剪接点lncRNA的序列丰度低，以及处理选择性剪接时的生物信息学分析复杂。

利用现有的RNA-seq比对软件HISAT2、TopHat2以及Mapsplice2，在参考转录组的辅助下检测lncRNA转录异构体的灵敏度低于20％。在寻找新的转录异构体时，需要对测序序列进行从头组装，然而，从头组装软件在转录异构体上表现不佳，只能检测少量的lncRNA。

之前一篇发表在《Nature Biotechnology》上的文章就指出了转录本特异性分析的挑战：“选择性转录本的表达谱分析需要了解基因的所有选择性转录本，并且需要组合各个转录本的信息”，“对于全基因组范围的RNA-seq而言，这一点特别困难，因为许多转录本的少量序列存在采样噪音。”显然，人们需要一种新方法来开展转录本特异性的lncRNA研究。

基于对GENCODE转录本的分析，lncRNA的表达水平约为mRNA的十分之一。许多lncRNA在每个细胞中仅存在几个拷贝。尽管它们的丰度很低，但是lncRNA仍能有效运作。例如，一些lncRNA被拴在邻近基因上，显著改变它们的表达。

lcnRNA芯片

Arraystar LncRNA基因表达芯片在同一芯片上分析lncRNA和整组已知的mRNA。通过剪接点特异性探针或独特的外显子序列，它可靠地检测每条RNA转录本及其异构体。 Arraystar LncRNA实验方案已经过优化，可产生灵敏、可靠和准确的数据，包括芯片原始数据处理、数据质量控制、基因表达聚类和热图、差异表达的lncRNA和mRNA、lncRNA亚类、lncRNA与mRNA之间的调控关系，以及通路分析。

Arraystar LncRNA芯片依赖于那些经过全面注释和实验验证的lncRNA，而不是那些“无名的”部分降解的RNA片段。这些全长lncRNA已经过鉴定，至少有一篇Pubmed研究论文发表，因此代表了lncRNA的金标准。全面注释越来越被视为了解lncRNA生物学功能的最短途径。

Arraystar LncRNA芯片有着丰富的注释和分析，它们专门针对非编码调控lncRNA，与传统的编码mRNA分析大不相同。

案例研究

多年来，Arraystar芯片一直伴随着lncRNA的研究人员。在一篇去年发表在《Nature Cell Biology》的文章中，Arraystar LncRNA芯片帮助研究人员分析总RNA以及与脂质结合的RNA，以鉴定对三阴乳腺癌有病理学意义的lncRNA。

在这项研究中，MD安德森癌症研究中心的林爱福研究团队从三阴乳腺癌病人的组织中，鉴定到9个能与脂质结合的长链非编码RNA。其中，LINK-A的表达水平最高且最特异，被选中作为研究模型。研究表明，LINK-A在AKT激活中发挥重要作用，有望成为癌症治疗的新靶点。

早前，这个研究团队还在《Cell》杂志上发表文章，利用Arraystar LncRNA芯片发现晚期乳腺癌中lncRNA-BCAR4的差异表达，表明lncRNA在侵袭性乳腺癌进展中发挥了调控作用。

通过Arraystar lncRNA芯片筛查，研究人员发现lncRNA-BCAR4在乳腺癌病人组织中表达显著上升，并且随着肿瘤转移，上升趋势明显。通过进一步研究，他们发现BCAR4是GLI2控制的基因激活的必要条件。这是研究人员首次了解乳腺癌中lncRNA与hedgehog这一经典信号转导通路的联系。

结语

RNA转录组中的大多数是非编码的，因此lncRNA对细胞的调控机制给出了独特的观点。 不过，NGS在分析和鉴定lncRNA上缺乏足够的覆盖度、灵敏度和准确性，来阐明它们在疾病和健康上的生物学作用。

Arraystar LncRNA芯片克服了NGS的缺点，其探针能够灵敏地捕获和测定低丰度的lncRNA。因此，Shi博士认为芯片可作为研究lncRNA的首选方法。