百泰克血液RNA保存管

一、引言

全血作为较易获取的人体标本，特别适用于实验室和临床检测。高质量的 RNA可以满足 RT-PCR、qRT-PCR、Northern blot、基因表达谱、转录组测序、核酸酶保护实验和阵列分析等生物学下游实验的研究需求[1]。但由于RNA自身结构为单链状态，极不稳定，同时广泛分布的RNase时刻发挥着降解RNA的功能，其活性难以被抑制，因此使得从全血中提取RNA以及对RNA的保存相对困难。

常见的血液RNA保存方法有分离白膜层[2] 及专用的静脉真空采血管两种。分离白膜层法即加入RNAlater保护剂冻存-80℃。此种方法为目前样本库常用的血液RNA保存方法，采血后需在常温保存4小时内完成白膜层分离，或在采血2小时内放入4℃冰箱保存，24小时内4 ℃低温分离，将分离获得的白膜层用RNAlater保护剂保存，RNAlater的主要作用为提供高盐环境使细胞脱水，抑制核酸酶活性。此种方法的优势在于可将全血中大部分对于提取RNA无用的成分去除，缩减了样本的体积，更加便于保存。但此种方法的弊端在于，首先分离白膜层的过程较为繁琐，需要多次离心，在临床医院或临时的采血点往往难以实施，其次高盐脱水后的细胞复性困难，提取RNA的难度增加，且高盐组分不易去除，提取的RNA纯度不高，最后血液在分离白膜层过程中，会有部分白细胞及RNA组分缺失。通过我们前期的实验基础，我们也发现采用淋巴细胞分离液分离白膜层后，加入RNAlater保存液进行保存，造成白细胞失水皱缩，导致复性困难，提取RNA效果较差。

因此，本文探索了在不同保存温度及不同保存时间下，在专用的静脉真空采血管及特有的RNA保护剂下RNA的保存效果。希望本文可为广大的科研同胞们提供帮助。

二、材料和方法

2.1 标本来源

本组血液样品均采自同一志愿者，采用标准静脉穿刺技术，一次性使用真空采血管EDTA•Na₂ 5 ml（购于江苏康捷医疗器械有限公司）采集静脉血，全部标本白细胞计数范围为3.16×10³~3.25×10³。

2.2 方法

2.2.1 血液RNA保存管提取RNA

采集新鲜全血，30 min内转移2.5 ml至10 ml血液RNA保存管（购于BioTeke，Cat. ST1001）中，涡旋混匀30s，室温放置10 min，而后转移至不同条件保存。提取时取1.6 ml液体，恢复室温，放置10分钟，加入200 μl 氯仿，涡旋混匀10s，室温放置3 min；4 ℃ 12,000 rpm离心10min，吸取水相，加入等体积70%乙醇，混匀，将混合液加入RA柱，12,000 rpm离心1 min，弃滤液；加入500 μl 去蛋白液RE， 4℃ 12,000 rpm离心1 min，弃滤液；加入700μl 漂洗液RW，4℃ 12,000 rpm离心1 min，弃滤液；加入500 μl 漂洗液RW，4℃ 12,000 rpm离心1 min，弃滤液；4℃ 12,000 rpm离心2 min；将吸附柱RA插入新的1.5 ml离心管，加入30 μl RNase-free H2O 溶解3 min；12,000 rpm离心1min。

2.2.2 RNA质量检测

采用超微量紫外分光光度计测定紫外260nm处吸光度值计算RNA浓度，A260/A280和A260/230比值判断提取纯度。电泳时取5 μl 核酸，采用UltraPower核酸染料点染，2%琼脂糖凝胶，150V 电压条件下电泳15min拍照，曝光时间2s。

三、结果与分析

3.1 Bioteke RNA保存管保存结果与分析

表1. 血液RNA保存管在不同温度下保存3天后提取结果

编号	保存 温度		Abs260		Abs280	Abs230	260/230	260/280	样品浓度 （ng/μl）	样品 类型
1		25℃		2.676	1.367	3.551	0.75	1.96	107.0	RNA
2		25℃		3.358	1.788	3.116	1.08	1.88	134.3	RNA
3		4℃		2.952	1.592	3.21	0.92	1.85	118.1	RNA
4		4℃		2.81	1.398	1.718	1.64	2.01	112.4	RNA
5		-20℃		3.751	2.001	3.343	1.12	1.87	150.0	RNA
6		-20℃		3.029	1.583	2.564	1.18	1.91	121.1	RNA
7		-80℃		2.664	1.293	1.227	2.17	2.06	106.6	RNA
8		-80℃		3.766	2.068	4.455	0.85	1.82	150.6	RNA

 

图1. 血液RNA保存管在不同温度下保存3天后提取结果电泳图

表2. 血液RNA保存管在不同温度下保存7天后提取结果

编 号	保存 温度	Abs260	Abs280	Abs230	260/230	260/280	样品浓度 （ng/μl）	样品 类型
1	25℃	3.989	2.071	2.052	1.94	1.93	159.6	RNA
2	25℃	2.855	1.421	1.442	1.98	2.01	114.2	RNA
3	4℃	2.962	1.504	1.877	1.58	1.97	118.5	RNA
4	4℃	3.048	1.544	1.635	1.86	1.97	121.9	RNA
5	-20℃	2.421	1.217	1.542	1.57	1.99	96.8	RNA
6	-20℃	2.313	1.157	1.288	1.8	2	92.5	RNA
7	-80℃	2.755	1.468	2.825	0.98	1.88	110.2	RNA
8	-80℃	3.009	1.553	2.692	1.12	1.94	120.4	RNA

 

图2. 血液RNA保存管在不同温度下保存7天后提取结果电泳图

表3. 血液RNA保存管在不同温度下保存一年后提取结果

编号	保存 温度	Abs260	Abs280	Abs230	260/230	260/280	样品浓度 （ng/μl）	样品类型
5	-20℃	3.044	1.583	2.347	1.3	1.92	121.8	RNA
6	-20℃	2.889	1.466	1.789	1.61	1.97	115.5	RNA
7	-80℃	2.739	1.418	1.841	1.49	1.93	109.6	RNA
8	-80℃	3.664	1.943	3.27	1.12	1.89	146.6	RNA

 

图3. 血液RNA保存管在不同温度下保存一年后提取结果电泳图

分析：样本经Bioteke血液RNA保存管保存3天时，25 ℃、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃保存条件下的RNA得率无明显的差异，平均为8.75 μg/ml；保存7天的结果RNA平均得率为9.82 μg/ml，25 ℃的血液开始降解；-20 ℃- -80 ℃保存1年血液RNA无明显降解（表4~6，图1~3）。因此，全血经Bioteke血液RNA保存管保存后，效果优。

四、讨论

血液中核酸绝大部分存在于白细胞当中，而白细胞仅占血液成分1%左右，并且血液中含有丰富的RNA酶，这就使得血液的保存以及RNA提取变得十分棘手。

通过本文实验，采用Bioteke血液RNA保存管保存血液，其3天、7天、1年的平均得率为9.33 μg/ml， Bioteke核酸得率约为市面上常用的B某公司 Blood RNA Tube采血管的7.8倍。

此外全血采集后直接冻存-80℃也可作为一种保存血液的方式，已有研究表明，尽管低温可以抑制酶的活性，但即使在-20 ℃甚至-80 ℃中，RNase还可以缓慢发挥功能，-80 ℃保存一周的RNA浓度和纯度与新鲜全血相比均略有下降，需要进行RNA提取的全血标本保存时间最好不要超过4个月。

在实验中我们还发现，血液RNA保存管在7天左右的常温条件下也可保存较高质量的核酸，这个特性可解决采血后因实验设备落后无法及时处理血液的问题以及运输不便利的难题。
 
参考文献
[1] 章佳英, 嵇承栋, 万悦竹,等. 生物样本库中血液RNA提取方法的介绍[J]. 中国医药生物技术, 2017, 12(1):84-87.
[2] 李慧, 刘春燕, 李浩龙,等. 分离白膜后血浆制备冷沉淀的质量评价[J]. 中国输血杂志, 2015, 28(4):396-398.