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基于CRISPR的两种核酸检测新工具[新品推荐]

【字体: www.ebiotrade.com 时间:2018年09月07日 来源:生物通

摘要:

  CRISPR技术的两大豪门实验室分别开发出了一种工具。张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发和优化了一种方法,包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的实验室则利用Cas2a的非特异性ssDNA降解开发出另一种称为DETECTR的方法。

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检测核酸的时候,大家都希望特异性和灵敏度越高越好。然而,目前的检测方法要么缺乏灵敏度,要么缺乏特异性,要么太贵太复杂,总之,缺点一大堆。好在,科学家近日利用Cas9蛋白的变体Cas13和Cas12a开发出简单又便宜的平台,能够可靠检测低水平的核酸。

CRISPR技术的两大豪门实验室分别开发出了一种工具。张锋实验室利用Cas13蛋白的天然RNase活性开发和优化了一种方法,包括SHERLOCK和SHERLOCK v2。Jennifer Doudna的实验室则利用Cas2a的非特异性ssDNA降解开发出另一种称为DETECTR的方法。

SHERLOCK和DETECTR分别利用Cas13和Cas12a对邻近ssRNA和ssDNA的切割和降解,来切割和激活报告基团。随后对这个报告基团产生的信号进行测定,即可确定感兴趣的DNA、RNA或突变是否存在。这两个系统都证实了CRISPR在诊断上的潜力。

SHERLOCK

Cas13(C2c2)是在2016年由张锋实验室发现的。在单个CRISPR RNA(crRNA)的引导下,它能够切割ssRNA或mRNA(类似于RNA干扰),实现基因敲低方面的应用。同时,Cas13还附带非特异性的ssRNA切割功能。SHERLOCK方法利用Cas13的混合RNase活性以及可淬灭的ssRNA报告基团,通过等温扩增步骤来快速检测单个DNA或RNA分子。

工作原理

在crRNA的引导下,Cas13识别并结合目标序列,这激发了它对周围ssRNA分子的“胡乱”切割。激活的Cas13切割可淬灭的荧光RNA,产生可定量的信号,表示目标核酸的存在。为了提高分析的灵敏度,样品的DNA或RNA首先经过RPA或RT-PRA扩增。RPA与T7转录相结合,将扩增后的DNA转化为RNA,便于后续的Cas13检测。这些步骤使得SHERLOCK的灵敏度达到attomolar,特异性达到单碱基错配。

张锋实验室曾经证实SHERLOCK系统能够可靠检测亲缘关系相近的寨卡病毒和登革热病毒。它可检测血清、尿液和唾液中低浓度的寨卡病毒,并确定病毒载量,区分不同病毒株。它还可以对人类DNA进行基因分型,并鉴定游离DNA中的低频率癌症突变。

SHERLOCK v2

当然,SHERLOCK也存在一些限制。第一个限制是定量,因为系统依赖DNA的预扩增,这会导致报告基团饱和。SHERLOCK v2则在预扩增步骤中使用较少的引物,可以实现更好的定量而不影响灵敏度。研究人员还综合考虑多种Cas酶的切割偏好来创建一个多重平台。比如,在同一个反应中使用Cas13和Cas12a以及不同的荧光报告基团,可以准确检测多个目标。

SHERLOCK的第二个限制是它对荧光的依赖,这需要额外的设备来获取数据。于是,研究人员又对SHERLOCK v2进行了改进,让切割后的报告基团可通过试纸条来检测,就像验孕棒一样。这样,通过试纸条上的条带数量,就能确定目标DNA或RNA是否存在于特定样品中。试纸条方便运输,操作简单,不到一小时就能出结果,因此核酸检测可随时随地开展。

SHERLOCK v2这种核酸检测方法具有高灵敏度和高特异性,且不影响速度、易用性和便携性。因此,未来具有广阔的应用前景,包括临床诊断(比如病原体或病毒检测)、治疗和基因分型。SHERLOCK v2的优点在于实验室和现场都能轻松高效地开展。

DETECTR

Cas12a(Cpf1)是CRISPR Cas的一种变体,与Cas9一样能够切割dsDNA。不过,Cas12a识别不同的PAM位点,催化其自身的向导RNA成熟,并在dsDNA断裂后产生5’和3’交错的末端,特别适合基因编辑。

Jennifer Doudna的实验室在研究中发现,通过crRNA靶向感兴趣的dsDNA目标后,Cas12a还能以非特异性的方式切割ssDNA。这种非特异性的反式切割表现出多次周转事件(每秒约1250次)。于是,Doudna实验室便利用Cas12a的DNase活性开发出高度灵敏的DNA检测平台DETECTR。

工作原理

DETECR的工作原理与SHERLOCK相似。Cas12a通过crRNA靶向特定的DNA序列,如人乳头瘤病毒(HPV)基因组。同时将ssDNA-荧光淬灭(FQ)报道基团加入反应中,它在ssDNA降解时产生信号。为了提高灵敏度,首先通过RPA的等温扩增来扩增DNA。当Cas12a-cRNA与目标dsDNA配对时,Cas12a的DNase活性启动。随后,周围的ssDNA被降解,包括ssDNA-FQ报道基团在内。荧光信号可指示您感兴趣的DNA是否存在。

作为概念证明,研究人员利用DETECTR方法来检测HPV。他们发现,DETECTR可以在一小时内准确地区分人类细胞中两种相似的HPV亚型,HPV 16和HPV 18,灵敏度达到attomolar。因此,DETECTR具有快速检测患者样品中特定目标的能力,且具有高选择性和灵敏度。

DETECTR能够高效检测混合样本中的核酸,适用于一系列分子和临床诊断应用。Mammoth Biosciences公司已经着手对DETECTR技术进行开发,它的目标是提供基于CRISPR的平台 ,并以此基础开发各种生物传感的检测。(生物通 薄荷)

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