Nature子刊：慢性胰腺炎动物模型是如何开发的？

波士顿大学口腔医学院的Andrea Geisz和Miklós Sahin-Tóth开发出一种T7D23A基因敲入小鼠，以填补此领域的空白。这种小鼠携带阳离子胰蛋白酶原（T7亚型）的杂合p.D23A突变，为胰腺炎的研究和治疗提供了出色的模型。

　　

胰腺炎是因为胰蛋白酶的自身消化作用而引起的疾病，包括急性胰腺炎、复发性急性胰腺炎和慢性胰腺炎。这些疾病常常引起腹痛、恶心、呕吐、发热等症状，但并没有特异性疗法。

以往的研究表明，编码消化蛋白酶或其抑制剂的基因若发生突变，则往往会促进急性胰腺炎的发生，并逐渐发展成慢性胰腺炎。例如，PRSS1（阳离子胰蛋白酶原）、CTRC（胰凝乳蛋白酶C）以及SPINK1（Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂1）的致病突变通过刺激自发激活或干扰保护机制，从而促进胰蛋白酶原转化成有害的胰蛋白酶。

不过，基因突变引起的胰腺内胰蛋白酶原自发激活具有直接致病作用，这虽然获得了大量的遗传和生化证据支持，但目前还缺乏适当动物模型的确认。更重要的是，动物模型的缺乏还阻碍了胰蛋白酶抑制剂的临床前试验。

为此，波士顿大学口腔医学院（Henry M. Goldman School of Dental Medicine）的Andrea Geisz和Miklós Sahin-Tóth开发出一种T7D23A基因敲入小鼠，以填补此领域的空白。这种小鼠携带阳离子胰蛋白酶原（T7亚型）的杂合p.D23A突变，为胰腺炎的研究和治疗提供了出色的模型。这项成果近日发表在《Nature Communications》上。

T7D23A基因敲入小鼠的开发

小鼠基因组包含20个胰蛋白酶原基因。之前的研究表明，只有四种胰蛋白酶原高水平表达，它们分别是：T7、T8、T9和T209亚型。其中，T7亚型占胰蛋白酶原总量的40-50%，并且与其他亚型相比自发激活更快，产生的胰蛋白酶水平也更高。

为了产生自发激活增加的T7突变体，研究人员在激活肽中引入了Ala突变，以取代Asp23（p.D23A）。为了在体外测试T7 p.D23A突变体的激活特性，他们纯化了重组野生型和突变型T7胰蛋白酶原，并测定了自发激活。与野生型相比，p.D23A突变体的自发激活显著增加了50倍，同时，其他胰蛋白酶激活和降解途径不受影响。

之后，研究人员委托赛业生物（Cyagen）制备了T7D23A基因敲入小鼠，具体是通过C57BL/6胚胎干细胞中的同源重组将p.D23A突变引入小鼠基因组（图1）。DNA测序表明，这些杂合小鼠在突变位点显示出两个高度相当的峰，表明野生型和突变型等位基因的表达水平相当。新的T7D23A品系未出现明显的表型改变，并且正常繁殖。

 
图1. p.D23A突变对胰蛋白酶原T7亚型的影响。

T7D23A小鼠出现自发的急性和慢性胰腺炎

研究人员对T7D23A小鼠的胰腺形态进行观察，发现2-3周时是正常的，但4-5周时变化较大，而2个月后胰腺明显变小。组织学检测发现，T7D23A小鼠从第3周开始出现典型的急性胰腺炎，在4-5周出现得更加频繁（~40%）。水肿破坏了紧密排列的组织结构，大量炎性细胞浸润，且小叶出现中心局部坏死（图2）。

在4-5周时，研究人员发现超过一半的小鼠表现出明显的疾病进展。它们的胰腺切片显示出广泛的再生指征，包括假管复合物出现、胰管扩张和弥漫性间质纤维化，这些都是早期慢性胰腺炎的特征。从2个月开始并持续到6至12个月，脂肪开始在组织学图像中占据主导地位，而炎性细胞和假管复合物的数量开始减少。在扩张胰管的周围纤维化更普遍，有时还充满嗜酸性物质，这些是晚期慢性胰腺炎的特征。

 
图2. T7D23A小鼠的胰腺组织学。

之后，研究人员将T7D23A小鼠的胰腺重量与C57BL/6N对照小鼠进行比较，发现约40%的小鼠在4-5周龄表现出明显增加。这种增加与组织切片上观察到的水肿性急性胰腺炎一致。大约50%的小鼠在4-5周龄时胰腺重量明显减轻，表明早期慢性胰腺炎的出现。所有T7D23A小鼠在2月、6月和12月龄时显示出与晚期慢性胰腺炎相关的胰腺萎缩，与对照小鼠相比胰腺重量减轻约70%。

T7D23A小鼠的酶活检测

淀粉酶是诊断急性胰腺炎最常用的指标。因此，研究人员也测定了各个年龄的T7D23A小鼠血浆中的淀粉酶活性。在4-5周时，他们在约40%的小鼠中观察到淀粉酶值偏高，这与之前的结果一致。不过，并非所有小鼠都能捕获到急性胰腺炎的指标，这可能与采样时间和发病年龄有关，也可能是小鼠在没有急性发作的情况下患上慢性胰腺炎。

接着，他们以3周龄（无病理变化）、4周龄（急性或早期慢性胰腺炎）和2月龄（晚期慢性胰腺炎）T7D23A小鼠为对象，测定了新鲜制备的胰腺匀浆液中的胰蛋白酶活性。与相同年龄的对照小鼠相比，3周时未检测到胰蛋白酶活性的升高，但在4周时检测到高值。尽管功能性腺泡细胞减少，但在2个月时仍观察到酶活的升高，表明胰腺内胰蛋白酶的激活在整个疾病过程中持续存在。这些结果支持了，胰蛋白酶原的自发激活可引起急性胰腺炎发作，且随后发展成慢性胰腺炎。

为了排除与胰蛋白酶原自发激活无关的疾病机制，研究人员还制备了p.D23A、K24G双突变的小鼠品系，除了带有杂合的T7D23A等位基因，胰蛋白酶原激活位点Lys24也经过突变。这种小鼠在5.5个月时没有出现自发的胰腺病理变化。这个结果提供了令人信服的证据，说明胰蛋白酶原错误折叠等机制并不引起T7D23A小鼠的表型。

T7D23A小鼠与人类胰腺炎的特征比较

研究人员认为，这种新模型概括了人类胰腺炎的临床疾病特点，它总是先发展为急性胰腺炎，然后再发展为不可逆的慢性胰腺炎。不过，他们没有观察到人类经常出现的急性病情反复发作。这种差异可能是由此处所用的胰蛋白酶原突变造成的。

研究人员认为，他们展示了第一个慢性胰腺炎的临床前小鼠模型，该疾病是由胰腺内胰蛋白酶原自发激活的增加所驱动的。这个模型概括了人类慢性胰腺炎的显著特征。值得一提的是，尽管T7D23A小鼠出现明显的病理变化，但它们能够正常繁殖并发育到成年期，这是临床前应用的先决条件。

“在概念层面，这个模型提供了直接的体内证据，表明胰蛋白酶原的自发激活可驱动慢性胰腺炎的发作和发展，且治疗方法应针对胰腺内的胰蛋白酶，”研究人员总结道。（生物通 余亮）

原文检索

A preclinical model of chronic pancreatitis driven by trypsinogen autoactivation
Andrea Geisz & Miklós Sahin-Tóth

Nature Communications 9, Article number: 5033 (2018)