寻找新的肿瘤靶标基因，让课题、文章、专利一网打尽

　　

常规的肿瘤靶标基因研究策略起始于临床样本的差异表达谱分析（包括测序、芯片和质谱方法等），从肿瘤与对照癌旁或正常组织之间寻找差异表达基因，确定候选靶标。但是根据吉凯十几年的肿瘤靶标基因研究经验，从成百上千的差异基因中筛选到新功能靶标基因的概率只有10%左右，难度非常大。吉凯基因历经3年，斥资上亿，完成近6000个肿瘤相关基因的功能学筛选（包括编码基因以及lncRNA），已从中找到明确的新的肿瘤关键靶标基因若干，并借助TCGA数据库，确认该基因的临床相关性。这些基因满足了申请课题，发表文章，申请专利的基本需求。为满足不同档次的课题以及文章分值要求，吉凯基因科研专家团队围绕目的基因设计了不同的研究方案，保证方案能够优质、顺利的执行。

方案概览：
方案一：

方案二：

方案三：

方案四：

 

结果展示：
1、 初步筛选目的功能基因：通过TCGA大数据，分析出与生存期相关的基因，将候选基因shRNA慢病毒感染靶细胞，使靶细胞内源表达的候选基因表达下调，通过Cellomics高内涵功能筛选（HCS）平台对感染后的细胞进行4～5天细胞计数，观察候选基因表达下调后的细胞与对照细胞相比细胞增殖（或划痕愈合）的变化，从而推断对细胞增殖（转移）有影响的基因。
示例图：

 

2、 目的基因细胞功能验证：用shRNA慢病毒在靶细胞中沉默目的基因，qPCR和WB验证目的基因在细胞中的敲减效率，并在两株细胞上进行MTT/细胞周期（PI/流式法）/凋亡（Annexin V/流式法）/BrdU/克隆形成等增殖方向的功能学实验以及转移方向功能学实验（划痕愈合/Transwell迁移/Transwell侵袭等）。分组：NC vs KD，每组三个复孔。承诺在两株肿瘤靶细胞中该基因敲减后的至少3个增殖方向（含HCS增殖检测）的功能学阳性实验结果或者2个转移方向（含HCS转移检测）的功能学阳性结果。
示例图—增殖方向实验：

 
示例图—转移方向实验：

 

3、 目的基因体内功能验证：制备目的基因敲低实验组或对照组成瘤细胞，注射裸鼠皮下或者尾静脉，构建裸鼠皮下成瘤模型或者尾静脉肿瘤转移模型，饲养裸鼠至瘤体长成，记录动物体重，瘤体大小曲线或进行活体成像，处死后收集瘤体称重，处理数据结果。
示例图：

4、 目的基因作用机制研究：运用co-IP质谱筛选互作蛋白，通过构建在目的基因（bait）的N端融合3×FLAG标签（3×FLAG-bait）的载体，制备慢病毒，感染细胞，筛选过表达稳定株以及对照稳定株，收集细胞蛋白，用Anti-Flag抗体进行IP，SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，与对照组相比切割目的组差异条带，酶解提取肽段进行LC-MS/MS测试分析，通过数据库检索完成蛋白的鉴定，分析筛选互作蛋白，进一步通过候选互作蛋白的特异性抗体进行co-IP结合验证。
示例图：

5、 阳性互作基因与目的基因功能回复验证：对筛选到的阳性互作蛋白，构建携带红色荧光的干扰或过表达载体，在一株细胞株中干扰目的基因（感染携带绿色荧光的干扰慢病毒）的同时干扰或过表达阳性互作蛋白（感染携带红色荧光的干扰或过表达慢病毒），通过HCS连续5天扫版观察黄色荧光细胞增殖能力的变化，验证下游机制基因对目的基因的功能回复作用，并获得一个增殖相关和一个转移相关功能学实验的阳性回复实验结果，实验分组：NC（目的基因）+NC（下游机制基因）；KD（目的基因）+NC（下游机制基因）；KD（目的基因）+OE/KD（下游机制基因）。
示意图：

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