错误率骤降98%！细菌完成图3.0怎么做到的？

　　

细菌基因组de novo是对细菌基因组测序后从头组装，并在组装的基础上，进行基因组组分分析、功能注释等分析。它是研究细菌进化遗传机制、关键功能基因的重要工具。细菌完成图（1 contig, 0 gap）是细菌基因组de novo组装追求的最高指标。

根据测序技术的发展，细菌完成图研究大致可以分为三个阶段：

图1 细菌完成图不同方法优劣势比较

细菌完成图1.0

细菌完成图1.0是以短读长测序为基础，一般构建构建500bp左右的小片段文库和mate-pair文库（2K、6K、10K等），采用短读长测序，并进行de novo组装。要组装得到完成图，往往还需要在此基础上增加辅助组装手段（如bionano），并进行PCR补洞。该方法耗时长，成本高（10万元级），很大程度上限制了细菌完成图的应用范围。

细菌完成图2.0

细菌完成图2.0基于PacBio平台进行组装，是目前比较常用的策略。PacBio平台的超长读长reads，使从业人员很容易组装得到细菌完成图，组装周期和成本都有很大程度的降低（万元级）。虽然PacBio平台单碱基准确度较低（只有85%左右），但因其测序是随机错误，官方认为当测序深度达到30X以上时，组装准确度可达到Q50水平。为了进一步提高组装准确度，可以用高质量的短读长数据进一步对PB组装结果进行纠错，得到准确度较高的细菌完成图。

细菌完成图3.0 beta

Nanopore平台测序读长更长，建库测序步骤简单成本更低，近年来受到越来越多关注。不过，其也存在缺点——组装准确度相对较低。如图2所示，Nanopore数据单独组装，平均准确度仅有Q25，加上短读长数据纠错，平均准确度依然只有Q29，组装错误率达1‰以上，远低于PacBio组装准确度。

PacBio和Nanopore的测序错误都以插入缺失为主。细菌基因组紧凑，编码基因中无内含子，直接用Nanopore序列组装会引入大量的移码突变，影响后续基因组功能研究。我们暂且称Nanopore直接组装得到的细菌完成图为细菌完成图3.0 beta。

图2 ONT平台和PB平台组装准确度比较[1]

细菌完成图3.0 beta组装准确度主要受以下两个因素影响：

1）Nanopore测序准确度低，原始数据碱基准确度约为80%，碱基错误不随机，自纠错后准确度仍难以达到较高水平。直接用Nanopore数据组装准确度较差。

2）Nanopore数据拆分识别单端barcode数据即可拆分，因但碱基错误率高，可能存在数据拆分错误的情况。如果直接用Nanopore数据组装，会引入序列污染。

目前这两个问题还未能有效解决。为了得到更高质量的ONT细菌完成图，细菌完成图3.0 beta常用的策略是先用ONT组装得到完成图，然后用短读长数据去纠错（类似于细菌完成图2.0组装策略）。这个过程会在一定程度上提高组装准确度，但质量提升有限（如图1所示，加了短读长数据纠错，组装准确度仅由原来的Q25提升到Q29）；而且由于拆分错误引入的序列污染，无法通过纠错来避免。

图3 Nanopore细菌完整图组装示意图（Nanopore数据组装得到完成图，短读长数据纠错）

细菌完成图3.0

华大基因开发的细菌完成图3.0，可以有效避免上述两个因素引入的错误。华大基因采用BGISEQ和Nanopore数据联合组装的策略，不同于以往的联合组装，而是首先用高准确度的BGISEQ数据（Q30>80%）进行组装，得到高质量的细菌基因组骨架（contig）,然后用Nanopore数据将高质量contig连接成完成图。

该策略组装得到的细菌完成图，准确度由BGISEQ数据的准确度决定，而且可以有效避免Nanopore数据拆分错误引入的序列污染。

图4 华大BGISEQ+Nanopore细菌完整图组装示意图（BGISEQ数据组装得到高质量框架图，Nanopore数据进一步提升组装指标得到完成图。）

细菌完成图3.0基因组准确度高，完整性好，成本更低，可作为细菌完成图研究的首选策略。

组装准确度高达Q47

组装准确度高达Q47（错误率0.02 ‰ ），错误率仅相当于原来的2%（nanopore组装短reads纠错，错误率在1‰左右）。

表1. 测试数据展示——BGISEQ+Nanopore组装准确度

*该样品与NCBI上的参考基因组可能不是同一菌株。

可得到完整基因组和质粒信息

细菌完成图3.0可以组装得到完整的基因组，并获得质粒信息（测试数据质粒组装完整度达到90%以上）。

表2. 测试数据展示——BGISEQ+Nanopore组装完整度

**未装出来的两个质粒在参考基因组中也未组装完整。

性价比高

华大基因Nanopore平台产出和数据质量菌达到Nanopore认证标准，并已取得Nanopore官方颁发的测序服务资格认证证书。每个cell可以满足24个细菌样本pooling建库测序，单样本成本低。具体价格可咨询当地科技代表。

图5 Nanopore认证证书

参考文献：

1. Wenger A M, Peluso P, Rowell W J, et al. Highly-accurate long-read sequencing improves variant detection and assembly of a human genome[J]. bioRxiv, 2019: 519025.