Nanopore人重，买一送一！大小变异All in One

　　

长读长技术日渐成熟，并逐渐迈向个人基因组检测，其优势在于以低成本快速获取准确、全面的基因组变异信息。基于长读长测序在检测SV中的优势，华大科技推出了Nanopore人重（送DNBSEQ 0 PCR 90G 人重）高性价比的完美人全基因组变异检测产品，使其身兼短读长、真正0 PCR和长读长的优势，可解决短读长和长读长的技术弊端，高精准检测SNP、InDel和SV。

短读长无法有效检测大的结构变异（SV）

短读长测序由于读长和插入片段较短，检测SV具有偏向性，并且无法通过算法升级解决[1]。

为了更直观地看到短读长测序对SV的检测能力，我们采用了delly和manta两个软件对人标准品NA12878的SV进行评估，结果显示各短读长测序平台在SV变异的检测能力都不尽如人意，对于缺失和倒位变异检测的真阳性率（50%-60%）已经很低了，而对于重复和插入的检测更是几乎不可能。

图1 短读长测序平台SV检测真阳性率

长读长测序无法有效检测小的SNP和InDel

对于单核苷酸错误率为5%-15%的单分子长读长测序，准确鉴定DNA序列的突变尤为困难[2]。

今年3月份，《Nature communications》发表了题为《A multi-task convolutional deep neural network for variant calling in single molecule sequencing》的文章，将短读长测序检测出的SNP和InDel表现，与PacBio和ONT平台的检测结果进行比较。研究人员选取每个平台不同训练模型中表现最好的F1 score（F1 score越高表示假阳与假阴越少），发现SNP F1 score短读长比长读长测序平台高出5个百分点，而对于小的InDel，短读长测序平台的检测能力高出长读长测序平台一倍！

图2 短读长和长读长测序平台SNP和InDel变异检测能力[2]

建库测序PCR扩增影响短读长测序的变异检测

PCR过程中可能会引入碱基错配，错误频率可达0.06%[3]，降低了DNA序列复制的保真性。对于核酸序列来说，由于其复杂的二级结构或热稳定性不好，会影响到PCR扩增效率，使得不同的基因组序列存在扩增偏向性，从而降低基因组覆盖度[4]。此外，PCR过程会引入错误的InDel[5]，当DNA两条链上的嘌呤嘧啶含量不平衡时会增加缺失发生的几率[6]，序列中PolyA结构、高GC含量的序列会增加复制滑移，从而增加了引入InDel的几率[7]。因此，PCR建库比PCR-free建库的WGS测序数据多引入3.4万个错误的InDel！

图3 PCR与PCR-free建库数据检测出错误的InDel数量

SNP、InDel和SV大小变异一网打尽

基于长读长测序自身的优势，其在寻找SV中有得天独厚的优势，为了评估DNBSEQ 0 PCR+Nanopore在人样本中检测SV的能力，我们检测在人血样本中的F-measure，结果显示DNBSEQ 0 PCR+Nanopore人重基因组检测中F-measure可高达86.81%，相比非DNBSEQ PCR提高了103%，相比单独Nanopore提高了2.3%。

华大自主平台DNBSEQ加上真正意义上的0 PCR建库，可完美检测SNP和InDel，结果显示，DNBSEQ 0 PCR+Nanopore的检测SNP的 F-measure高达99.74%，对InDel 的F-measure高达98.48%。

另外，我们评估错误变异数量，结果显示DNBSEQ 0 PCR+Nanopore错误变异数量相比Nanopore和非DNBSEQ PCR低。

图4 高F-measure检测SNP、InDel、SV

图5 DNBSEQ 0 PCR+Nanopore错误变异数量低
F-measure=2PR/(P+R)。P：精确度；R：召回率，精确度和召回率都高时, F-measure值也高

文献解读

SV的检测对于人类对相关疾病的研究至关重要，以下是相关案例。

案例1：种群SV检测及数据库建立[1]

结构变体涉及许多疾病，并构成人类基因组中不同核苷酸的大部分。由于SVs与SNV相比通常体积较大，因此与SNV或小型插入缺失相比，其功能影响更大[2]。因此很明显，对这种SV的更详细分析可以为我们提供未来疾病关联研究的重要信息。

长期以来，人们对SV的探索均是使用了短读长测序技术，该技术对于SV检测有着不缺准性，一直是无法解决的事情，特别是对于SV结构的复杂性研究。该文想构建第三版图的SV图谱，采用illumina测序技术对26个种群测序，对千人的SV进行了新的补充, 并探索出了48381个新的SV，同时采用Nanopore测序技术对PCR扩增产物测序来探索验证倒置序列的复杂性。

图6 对千人SV的补充并验证其复杂性

案例2：临床病患检测筛查诊断[3-4]

目前临床中很多疾病并未找到明确的基因变异与其关系，很大一部分是由于短读长测序的弊端所致。短读长因读长较短，对SV的检测存在更大的挑战。因此长读长测序的优势显然是在检测SV上。SV与人类疾病的关联性可能比我们目前所知的更大。

使用Nanopore测序平台对具有多种先天性异常的两名患者的基因组进行测序，两名患者都有复杂的表型，包括畸形特征和精神发育迟滞，可能是由于他们从头复杂的染色体重排，用Nanopore测序数据评估了在该覆盖率下检测这两名患者的复杂断裂点的性能，同时揭示了一些短读长数据遗漏的新变体。

图7 短读长数据遗漏的新变体

案例3：解复杂SV结构[5]

目前已经有许多疾病涉及SV，且被证实有直接联系，但是具体的SV结构并没有被解出。这影响了我们对疾病发病机理和分子机制的理解，因此解出这些复杂的SV至关重要。

良性家族性成人肌阵挛癫痫（BAFME）是一种常染色体显性遗传疾病，尽管人们对位于候选区域内的38种基因的所有外显子进行了全面的突变分析，包括拷贝数分析，但致病突变尚未确定。利用Nanopore测序平台对患有良性家族性成年人肌阵挛癫痫（BAFME）的病人测序，解出扩展重复配置的复杂SV结构。对51个家族测序，其中两个家族的重复配置出现在TNRC6A和RAPGEF2基因中，没有出现在常规SAMD12基因中，阐明了致病基因中的重复序列与疾病关系的新机理。

图8 扩展重复配置的复杂SV结构

Nanopore检测SV部分高分文章列表[1-9]

由此可见，DNBSEQ 0 PCR+Nanopore可高F-measure的检测SNP和InDel，再加上长读长Nanopore测序平台自身的优势可以获得高F-measure的SV，使得可高同时检测出SNP、InDel、SV等大小变异。有很大一部分原因是由于短读长测序存在一些弊端，因其读长短，对SV的检测存在更大的挑战，导致无法明确很多疾病与基因变异的关系。

华大科技推出了Nanopore人重【送DNBSEQ 0 PCR （90G，30X）】高性价比的完美人全基因组变异检测产品，不仅可以在检测SV的同时检测SNP、InDel，且价格低、周期短，是许多科研工作者的福音。

DNBSEQ PCR-free + Nanopore人全基因组重测序，大小变异，一个都不能少！

注：BGISEQ-500、MGISEQ-2000等华大自主测序平台都是基于DNBSEQ™技术，所以统称为DNBSEQ平台。

1. Sudmant, P. H. et al. An integrated map of structural variation in 2,504 human genomes. Nature 526, 75-81, doi:10.1038/nature15394 (2015).

2. Wong, J. H. et al. Identification of intermediate-sized deletions and inference of their impact on gene expression in a human population. Genome medicine 11, 44, doi:10.1186/s13073-019-0656-4 (2019).

3. Cretu Stancu, M. et al. Mapping and phasing of structural variation in patient genomes using nanopore sequencing. Nature communications 8, 1326, doi:10.1038/s41467-017-01343-4 (2017).

4. Euskirchen, P. et al. Same-day genomic and epigenomic diagnosis of brain tumors using real-time nanopore sequencing. Acta neuropathologica 134, 691-703, doi:10.1007/s00401-017-1743-5 (2017).

5. Ishiura, H. et al. Expansions of intronic TTTCA and TTTTA repeats in benign adult familial myoclonic epilepsy. Nature genetics 50, 581-590, doi:10.1038/s41588-018-0067-2 (2018).

6. De Coster, W. et al. Structural variants identified by Oxford Nanopore PromethION sequencing of the human genome. Genome Res 29, 1178-1187, doi:10.1101/gr.244939.118 (2019).

7. Bowden, R. et al. Sequencing of human genomes with nanopore technology. Nature communications 10, 1869, doi:10.1038/s41467-019-09637-5 (2019).

8. Sanchis-Juan, A. et al. Complex structural variants in Mendelian disorders: identification and breakpoint resolution using short- and long-read genome sequencing. Genome medicine 10, 95, doi:10.1186/s13073-018-0606-6 (2018).

9. Ebbert, M. T. W. et al. Long-read sequencing across the C9orf72 'GGGGCC' repeat expansion: implications for clinical use and genetic discovery efforts in human disease. Molecular neurodegeneration 13, 46, doi:10.1186/s13024-018-0274-4 (2018).