体内模型证实：单次CRISPR治疗对新生/成年小鼠DMD有长期益处

杜氏肌营养不良小鼠模型在单次CRISPR基因编辑和蛋白质修复一年后，仍能存活。

　　

杜克大学的研究人员表示，使用CRISPR基因组编辑技术进行单一系统治疗可以安全、稳定地纠正小鼠遗传疾病——杜氏肌营养不良（DMD），他们在2月18日的《Nature Medicine》发表文章。

2016年杜克大学生物医学工程副教授Charles Gersbach发表了首次利用CRISPR成功治疗遗传疾病动物模型的策略之一，该策略有可能转化为人类疗法。此后，许多其他例子逐渐发表，一些针对人类疾病的基因组编辑疗法目前也正在进行临床试验。

Gersbach的最新研究集中在一个DMD小鼠模型上，该模型因机体无法产生抗肌萎缩蛋白（dystrophin），这种长蛋白链将肌肉纤维内部与周围支持结构结合起来。

抗肌萎缩蛋白由一个包含了79个蛋白质编码区的基因编码，基因编码区被称为外显子，如果一个或多个外显子被遗传突变或删除，链就无法建立，导致肌肉缓慢地碎裂和退化。大多数病人都是10岁左右的轮椅依赖者，而他们的寿命通常不超过20岁或30岁出头。

Gersbach实验室的方法是使用CRISPR/Cas9减除基因突变周围的抗肌萎缩蛋白外显子，让身体天然DNA修复系统将剩余的基因重新缝合在一起，从而产生一个缩短但功能正常的抗肌萎缩蛋白版本。

“随着我们继续致力于开发基于CRISPR基因疗法，测试评估这一方法的各个方面迫在眉睫，”Gersbach说。“我们实验的一个目标是测试该领域的部分讨论想法，包括监测面对细菌Cas9蛋白的潜在免疫反应和长期持久性。”

之前为期8周的观察研究显示功能性抗肌萎缩蛋白恢复，肌肉力量增加，然而并未探索治疗的长期耐久性。

“人们普遍认为基因编辑会导致永久性的基因矫正，”Gersbach说。“重要的是探索可能破坏基因编辑效果的可能性，例如失去被治疗细胞或免疫反应。”

这项新研究的目的就是探索能够改变基于CRISPR/Cas9的基因编辑长效性的因素。

博后研究员Christopher Nelson对携带缺陷抗肌萎缩蛋白基因的成年和新生小鼠分别进行了单剂量的CRISPR治疗，在接下来的一年里，研究人员测量了多少肌肉细胞被成功编辑，发生了什么类型的基因改变，以及对细菌CRISPR蛋白，Cas9，产生的任何免疫反应。

其他研究报告指出，小鼠免疫系统可以对Cas9产生反应，这可能会干扰CRISPR疗法的益处。一些研究小组还报告说，有些人对Cas9蛋白有预先存在的免疫力，可能是因为以前接触过细菌宿主。

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“好消息是，尽管我们观察到Cas9对抗体和T细胞的反应，但这两种反应似乎都不会对小鼠产生任何毒性，”Nelson说。“这种反应也没有阻止抗肌萎缩蛋白的成功基因编辑和长期蛋白表达能力。”

研究结果提出了应对未来挑战的可能方法。例如，只有2天大的小鼠，免疫系统没有完全发育，因此未检测到免疫反应，CRISPR基因组编辑系统不仅保持稳定，在某些情况下，甚至在一年内得到了加强。可以畅想一下，将这种疗法提供给婴儿的也许是一种规避或调节不良免疫反应的方法。

然而，Gersbach和Nelson承认，老鼠的免疫系统通常与人类的截然不同。目前，DMD新生儿筛查还没有广泛开展，多数杜氏患儿诊断年龄在3至5岁。为了应对这一挑战，Gersbach说，在治疗过程中不排除需要抑制免疫系统。

研究人员还在调查限制Cas9在短时间内仅表达或传递给肌肉细胞的潜在策略，这一招也许能逃避免疫检测。

“所有小鼠在治疗后1年都表现良好，随着我们向大型动物模型迈进，仍需更多地关注免疫反应。”

Nelson和Gersbach之前曾讨论过CRISPR/Cas9的非目标编辑的可能性（脱靶），这篇报道指出可能的脱靶位点活性很小。但是最近其他研究报告称，CRISPR有时会在正确的位置但以不正确的方式进行基因编辑，例如，一些研究表明，CRISPR可切割比预期大得多的基因片段，或者DNA片段嵌入到切割处。这些类型的编辑以前在基因组编辑研究中都不曾报道，因为使用的方法只采用预期编辑。

为了全面地映射所有编辑，Nelson使用了一种DNA测序方法，不带目的性地如实报告任何类型编辑。令人惊讶的是，除了预期去除的靶外显子，小鼠体内还进行了许多类型编辑，包括病毒载体DNA序列的高水平插入。

根据组织类型和CRISPR剂量，多达一半的靶编辑造就了这些交替序列的改变。尽管结果有些吃惊，但这些“无意义”的序列变化似乎并不会影响CRISPR/Cas9基因编辑系统对DMD的安全性或有效性。

“在这种情况下，因为抗肌萎缩蛋白已经有缺陷了，才导致这些编辑不一定引起关注，”Nelson说。“但是，任何意想不到的结果都可能降低你正努力实现的基因编辑效率，这强调了客观识别的设计方式和替换编辑在未来研究中的重要性。”

“以前的研究表明，可能存在其他类型编辑，”Gersbach说。“而我们第一次使用治疗相关方法对动物模型中的这些事件进行了全面测量，在前进的道路上，使这一现象得到了进一步监控和理解。”

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原文检索：Long-term evaluation of AAV-CRISPR genome editing for Duchenne muscular dystrophy

（生物通：伍松）